萬誠 李蕾嘉 陳勝 王濟紅 王瑩

(貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009)

老鷹茶具消暑解渴、消食去脹、降血糖、降血脂、抑菌、消炎、抗氧化等獨特的功效，在西南地區(qū)，人們把老鷹茶作為盛夏的民間飲品及民間草藥[1]。國內(nèi)學(xué)者在生物活性成分和營養(yǎng)成分上的研究越來越深入，近30a來一直是開發(fā)利用研究的熱點[2]。老鷹茶基源植物的分類歸屬不明確，10a前報道的3屬2種2變種：木姜子屬朝鮮木姜子(Litsea coreana)的變種豹皮樟(L.coreana var.sinensis)和毛豹皮樟(L.coreana var.lanuginose)；潤楠屬川黔潤楠(Machilus chuanchienensis)和黃肉楠屬紅果黃肉楠(Actinodaphne cupularis)[3,4]；近年來被報道為4屬5種1變種：豹皮樟、川黔潤楠、紅果黃肉楠、木姜子(Litsea pungens)、狹葉潤楠(Machilus rehderi)和山胡椒屬香葉樹(Lindera communis)[5]。關(guān)于老鷹茶植物的葉綠體DNA遺傳多樣性分析鮮有報道，F(xiàn)eng等[6]對采自中國7省區(qū)的23份老鷹茶植物進行了trnH-psbA、trnL-trnF和trnT-trnL 3個葉綠體標記的測序，鑒定出8個單倍型，并將23份樣品聚為4個類群，認為老鷹茶植物基源為豹皮樟，但未將表觀性狀與DNA測序結(jié)果進行分析，不能為品種選育提供依據(jù)。Pan等[7]在Illumina MiSeq平臺上，對采自正安的豹皮樟變種的葉綠體DNA全基因組進行測序，并與29種樟科植物葉綠體基因組構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。本研究擬通過對老鷹茶原料植物DNA葉綠體分子標記分析其遺傳多樣性，研究結(jié)果將為老鷹茶植物的分類歸屬提供科學(xué)依據(jù)，為進一步開展良種選育與利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

老鷹茶植物分化為嫩芽被白色、被黃色和被粉紅色絨毛3種芽表現(xiàn)型的現(xiàn)象，目前根據(jù)開花、結(jié)實情況判斷，被白色絨毛芽表現(xiàn)型應(yīng)該為雄株表征，被紅色絨毛芽表現(xiàn)型應(yīng)該為雌株表征，被黃色絨毛芽表現(xiàn)型應(yīng)該為子代雜合體表征。

老鷹茶古樹樣品收集于貴州省遵義市湄潭縣境內(nèi)，針對紅芽雌株、黃芽雌株、黃芽雄株和白芽雄株4種性別表型共10株進行采樣，材料收集好后放入-80℃冰箱備用，樣本詳細信息見表1。

表1 供試老鷹茶樹信息

1.2 DNA提取

本試驗使用試劑盒法，選用上海生物工程股份有限公司的植物基因組DNA快速抽提試劑盒。

1.3 葉綠體DNA引物篩選

參考中華人民共和國林業(yè)行業(yè)標準LY/T 3191-2020 林木DNA條形碼構(gòu)建技術(shù)規(guī)程[8]，選出標記葉綠體基因的H-psbA與L-F間區(qū)進行PCR擴增，擴增序列見表2。

表2 所選葉綠體間區(qū)引物序列

1.4 PCR擴增體系及電泳

PCR擴增體系選用20μL體系：2×SanTaq PCR Mix 10μL、無菌水7μL、引物2μL、DNA1μL。PCR程序為94℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，以低于引物溶解溫度5℃復(fù)性45s，72℃延伸2min，共35個循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。

采用1%濃度瓊脂糖凝膠檢測已擴增好的目標片段，若目標條帶清晰，不拖尾，無雜帶干擾，說明擴增得到的是所需要的目標產(chǎn)物。

1.5 測序

將擴增得到PCR產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司進行測序。

1.6 數(shù)據(jù)分析

將上海生物工程股份有限公司反饋的葉綠體DNA序列進行處理。同源性對比在美國國家生物信息網(wǎng)站中NCBI的BLAST中進行；使用MEGA-X[9]軟件對2個葉綠體DNA間區(qū)正反向序列的拼接、比對與合并，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；將處理好的序列在美國國家生物信息網(wǎng)站NCBI中的BLAST中進行同源性對比；使用DnaSPver 6.0軟件[10]計算10份老鷹茶植物葉綠體DNA的遺傳多樣性參數(shù)，包括多態(tài)性變異位點(Vs)、單一突變位點(Ss)、插入-缺失位點(Is)、簡約信息位點(Ps)、核苷酸多樣性(Pi)、平均核苷酸差異(k)、單倍型數(shù)(h)、單倍型多樣性(Hd)、單倍型多樣性方差(Vh)、單倍型多樣性標準差(Sh)與Tajima’s D值，Tajima’s D是檢驗供試材料葉綠體DNA區(qū)域是否遵循中性進化模型的重要參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物電泳檢測

PCR擴增后檢測結(jié)果見圖1，2對葉綠體DNA擴增引物均擴增出清晰、單一明亮的目標條帶，均為試驗?zāi)繕似巍?/p>

圖1 2對葉綠體DNA引物擴增檢測結(jié)果

2.2 老鷹茶植物同源性比對

將拼接好的序列導(dǎo)入美國國家生物信息網(wǎng)站NCBI中的BLAST進行比對，比對后發(fā)現(xiàn)與GenBank中的Actinodaphne lancifolia(登錄號為NC_045251.1)的朝鮮木姜子種的相似值達100%。

2.3 老鷹茶植物葉綠體DNA多態(tài)性分析

通過2對葉綠體DNA通用引物對10份貴州省遵義市湄潭縣采集的老鷹茶植物的2個葉綠體DNA間區(qū)進行擴增，結(jié)果見表3、表4，2個區(qū)域H-psbA與L-F在所有樣本中的序列長度分別為530bp和446bp，其中，核苷酸多態(tài)性較高的區(qū)域為H-psbA，包含28個單一突變位點、11個簡約信息位點和5個插入-缺失位點；核苷酸多態(tài)性比較低的區(qū)域為L-F，僅含2個簡約信息位點和6個插入-缺失位點，沒有單一突變位點。2個葉綠體DNA間區(qū)序列組合之后序列長度為976bp，含有28個單一突變位點、13個簡約信息位點和11個插入-缺失位點，共計41個多態(tài)性變異位點。

表3 供試老鷹茶植物的2個葉綠體DNA區(qū)域的多態(tài)性信息

表4 供試老鷹茶植物葉綠體DNA單倍型多樣性信息

10份老鷹茶植物的4個葉綠體間區(qū)共有多態(tài)性變異位點41個，2個區(qū)域H-psbA與L-F的變異位點分別為39個和2個，區(qū)域H-psbA含有其中95.1%的變異位點，是老鷹茶植物葉綠體DNA間區(qū)中多態(tài)性較高的區(qū)域。H-psbA區(qū)域的核苷酸多樣性(Pi)為0.01892，平均核苷酸差異(k)為9.933；L-F區(qū)域的核苷酸多樣性(Pi)為0.00212，平均核苷酸差異(k)為0.933。H-psbA區(qū)域的單倍型數(shù)目(h)與單倍型多樣性(Hd)較高，分別為9個和0.978，但其單倍型多樣性方差(Vh)和單倍型多樣性標準差(Sh)較低，分別為0.00292和0.054；L-F區(qū)域的單倍型數(shù)目(h)與單倍型多樣性(Hd)較低，分別為2個和0.467，但其單倍型多樣性方差(Vh)和單倍型多樣性標準差(Sh)較高，分別為0.01736和0.132。

10份老鷹茶植物的2個葉綠體DNA間區(qū)組合之后的片段共有10個單倍型，其核苷酸多樣性(Pi)、平均核苷酸差異(k)、單倍型多樣性(Hd)、單倍型多樣性方差(Vh)和標準差(Sh)分別為0.01126、10.867、1.000、0.002、0.045。

2.4 Tajima’s檢測

對2個區(qū)域進行Tajima’s測驗，結(jié)果見表5，trnH-psbA區(qū)域中的Tajima’s D值是負值，為-1.35554，trnL-trnF區(qū)域中的Tajima’s D值是正值，為1.03299，2個區(qū)域均在P>0.10水平上不顯著。2個葉綠體DNA間區(qū)序列組合之后的Tajima’s D值為-1.21568，在P>0.10水平上不顯著，說明合并后的片段遵循中性進化模型。

表5 10份老鷹茶植物葉綠體DNA片段的Tajima’s值

2.5 老鷹茶不同類型間遺傳關(guān)系

基于葉綠體DNA引物trnH-psbA與trnL-trnF擴增出來的序列通過合并后進行聚類分析，采用Neighbour-Joining(NJ)[11]的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2，黃芽株之間親緣關(guān)系較近，紅芽株之間親緣關(guān)系較近，白芽株與紅芽株、黃芽株之間親緣關(guān)系較遠，但該方法并不能有效區(qū)別黃芽株之間的雌雄差異，聚類結(jié)果與傳統(tǒng)解剖學(xué)分類結(jié)果大致相同，說明此聚類結(jié)果可信。

圖2 10份老鷹茶植物基于NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

學(xué)者Feng等[6]通過對中國7個省區(qū)的23份豹皮樟進行了trnH-psbA、trnL-trnF和trnT-trnL 3個葉綠體標記進行單倍體類型研究，本研究參考其方法，針對貴州省老鷹茶植物進行引物驗證，發(fā)現(xiàn)trnT-trnL區(qū)域測序結(jié)果出現(xiàn)重疊峰，因此本研究涉及到的葉綠體DNA區(qū)域為trnH-psbA與trnL-trnF。

在貴州省遵義市湄潭縣所收集的老鷹茶古樹樣本，測序后將trnH-psbA與trnL-trnF這2個葉綠體DNA區(qū)域合并后發(fā)現(xiàn)，有28個單一突變位點、13個簡約信息位點和11個插入-缺失位點，共計41個多態(tài)性變異位點，2個區(qū)域H-psbA與L-F的變異位點分別為39個和2個。區(qū)域H-psbA是老鷹茶植物葉綠體DNA間區(qū)中多態(tài)性較高的區(qū)域，變異位點占95.1%，包含28個單一突變位點、11個簡約信息位點和5個插入-缺失位點，可見區(qū)域H-psbA的突變類型主要表現(xiàn)為單一位點突變；區(qū)域L-F僅含2個簡約信息位點和6個插入-缺失位點，沒有單一突變位點，可見該區(qū)域突變類型主要表現(xiàn)為插入-缺失位點。通過計算得到貴州老鷹茶植物的葉綠體DNA核苷酸多樣性(Pi)為0.01126，單倍型多樣性(Hd)為1.000。在Tajima’s測驗中發(fā)現(xiàn)，區(qū)域H-psbA與L-F在各檢驗水平上均不顯著，說明這2個葉綠體DNA區(qū)域在進化上遵循中性模型，在分子水平導(dǎo)致進化的原因不是自然選擇，而是突變壓力和遺傳漂變。

貴州省遵義市湄潭縣老鷹茶葉綠體DNA序列與GenBank中的Actinodaphne lancifolia(登錄號為NC_045251.1)的朝鮮木姜子種的相似值達100%。將10份老鷹茶植物基于葉綠體DNA引物trnH-psbA與trnL-trnF擴增出來的序列通過合并進行聚類分析，采用Neighbour-Joining(NJ)[11]的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，能夠有效區(qū)分白芽株、紅芽株、黃芽株，但不能有效區(qū)分黃芽株之間的雌雄差異。在10份老鷹茶植物中，黃芽雄株2號(YM2)的聚類結(jié)果較為特殊，距離其他黃芽株都較遠，距離白芽雄株更近，由于黃芽株是白芽株與紅芽株的后代，屬于雜合株，可能黃芽雄株2號(YM2)的父本優(yōu)勢較強而表現(xiàn)的，該部分猜想還需下一步試驗來驗證。