萬誠 李蕾嘉 陳勝 王濟(jì)紅 王瑩

(貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009)

老鷹茶具消暑解渴、消食去脹、降血糖、降血脂、抑菌、消炎、抗氧化等獨(dú)特的功效，在西南地區(qū)，人們把老鷹茶作為盛夏的民間飲品及民間草藥[1]。國內(nèi)學(xué)者在生物活性成分和營養(yǎng)成分上的研究越來越深入，近30a來一直是開發(fā)利用研究的熱點(diǎn)[2]。老鷹茶基源植物的分類歸屬不明確，10a前報(bào)道的3屬2種2變種：木姜子屬朝鮮木姜子(Litsea coreana)的變種豹皮樟(L.coreana var.sinensis)和毛豹皮樟(L.coreana var.lanuginose)；潤楠屬川黔潤楠(Machilus chuanchienensis)和黃肉楠屬紅果黃肉楠(Actinodaphne cupularis)[3,4]；近年來被報(bào)道為4屬5種1變種：豹皮樟、川黔潤楠、紅果黃肉楠、木姜子(Litsea pungens)、狹葉潤楠(Machilus rehderi)和山胡椒屬香葉樹(Lindera communis)[5]。關(guān)于老鷹茶植物的葉綠體DNA遺傳多樣性分析鮮有報(bào)道，F(xiàn)eng等[6]對采自中國7省區(qū)的23份老鷹茶植物進(jìn)行了trnH-psbA、trnL-trnF和trnT-trnL 3個(gè)葉綠體標(biāo)記的測序，鑒定出8個(gè)單倍型，并將23份樣品聚為4個(gè)類群，認(rèn)為老鷹茶植物基源為豹皮樟，但未將表觀性狀與DNA測序結(jié)果進(jìn)行分析，不能為品種選育提供依據(jù)。Pan等[7]在Illumina MiSeq平臺上，對采自正安的豹皮樟變種的葉綠體DNA全基因組進(jìn)行測序，并與29種樟科植物葉綠體基因組構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。本研究擬通過對老鷹茶原料植物DNA葉綠體分子標(biāo)記分析其遺傳多樣性，研究結(jié)果將為老鷹茶植物的分類歸屬提供科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步開展良種選育與利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

老鷹茶植物分化為嫩芽被白色、被黃色和被粉紅色絨毛3種芽表現(xiàn)型的現(xiàn)象，目前根據(jù)開花、結(jié)實(shí)情況判斷，被白色絨毛芽表現(xiàn)型應(yīng)該為雄株表征，被紅色絨毛芽表現(xiàn)型應(yīng)該為雌株表征，被黃色絨毛芽表現(xiàn)型應(yīng)該為子代雜合體表征。

老鷹茶古樹樣品收集于貴州省遵義市湄潭縣境內(nèi)，針對紅芽雌株、黃芽雌株、黃芽雄株和白芽雄株4種性別表型共10株進(jìn)行采樣，材料收集好后放入-80℃冰箱備用，樣本詳細(xì)信息見表1。

表1 供試?yán)销棽铇湫畔?/p>

1.2 DNA提取

本試驗(yàn)使用試劑盒法，選用上海生物工程股份有限公司的植物基因組DNA快速抽提試劑盒。

1.3 葉綠體DNA引物篩選

參考中華人民共和國林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LY/T 3191-2020 林木DNA條形碼構(gòu)建技術(shù)規(guī)程[8]，選出標(biāo)記葉綠體基因的H-psbA與L-F間區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增序列見表2。

表2 所選葉綠體間區(qū)引物序列

1.4 PCR擴(kuò)增體系及電泳

PCR擴(kuò)增體系選用20μL體系：2×SanTaq PCR Mix 10μL、無菌水7μL、引物2μL、DNA1μL。PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，以低于引物溶解溫度5℃復(fù)性45s，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min，4℃保存。

采用1%濃度瓊脂糖凝膠檢測已擴(kuò)增好的目標(biāo)片段，若目標(biāo)條帶清晰，不拖尾，無雜帶干擾，說明擴(kuò)增得到的是所需要的目標(biāo)產(chǎn)物。

1.5 測序

將擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。

1.6 數(shù)據(jù)分析

將上海生物工程股份有限公司反饋的葉綠體DNA序列進(jìn)行處理。同源性對比在美國國家生物信息網(wǎng)站中NCBI的BLAST中進(jìn)行；使用MEGA-X[9]軟件對2個(gè)葉綠體DNA間區(qū)正反向序列的拼接、比對與合并，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；將處理好的序列在美國國家生物信息網(wǎng)站NCBI中的BLAST中進(jìn)行同源性對比；使用DnaSPver 6.0軟件[10]計(jì)算10份老鷹茶植物葉綠體DNA的遺傳多樣性參數(shù)，包括多態(tài)性變異位點(diǎn)(Vs)、單一突變位點(diǎn)(Ss)、插入-缺失位點(diǎn)(Is)、簡約信息位點(diǎn)(Ps)、核苷酸多樣性(Pi)、平均核苷酸差異(k)、單倍型數(shù)(h)、單倍型多樣性(Hd)、單倍型多樣性方差(Vh)、單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差(Sh)與Tajima’s D值，Tajima’s D是檢驗(yàn)供試材料葉綠體DNA區(qū)域是否遵循中性進(jìn)化模型的重要參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物電泳檢測

PCR擴(kuò)增后檢測結(jié)果見圖1，2對葉綠體DNA擴(kuò)增引物均擴(kuò)增出清晰、單一明亮的目標(biāo)條帶，均為試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)片段。

圖1 2對葉綠體DNA引物擴(kuò)增檢測結(jié)果

2.2 老鷹茶植物同源性比對

將拼接好的序列導(dǎo)入美國國家生物信息網(wǎng)站NCBI中的BLAST進(jìn)行比對，比對后發(fā)現(xiàn)與GenBank中的Actinodaphne lancifolia(登錄號為NC_045251.1)的朝鮮木姜子種的相似值達(dá)100%。

2.3 老鷹茶植物葉綠體DNA多態(tài)性分析

通過2對葉綠體DNA通用引物對10份貴州省遵義市湄潭縣采集的老鷹茶植物的2個(gè)葉綠體DNA間區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見表3、表4，2個(gè)區(qū)域H-psbA與L-F在所有樣本中的序列長度分別為530bp和446bp，其中，核苷酸多態(tài)性較高的區(qū)域?yàn)镠-psbA，包含28個(gè)單一突變位點(diǎn)、11個(gè)簡約信息位點(diǎn)和5個(gè)插入-缺失位點(diǎn)；核苷酸多態(tài)性比較低的區(qū)域?yàn)長-F，僅含2個(gè)簡約信息位點(diǎn)和6個(gè)插入-缺失位點(diǎn)，沒有單一突變位點(diǎn)。2個(gè)葉綠體DNA間區(qū)序列組合之后序列長度為976bp，含有28個(gè)單一突變位點(diǎn)、13個(gè)簡約信息位點(diǎn)和11個(gè)插入-缺失位點(diǎn)，共計(jì)41個(gè)多態(tài)性變異位點(diǎn)。

表3 供試?yán)销棽柚参锏?個(gè)葉綠體DNA區(qū)域的多態(tài)性信息

表4 供試?yán)销棽柚参锶~綠體DNA單倍型多樣性信息

10份老鷹茶植物的4個(gè)葉綠體間區(qū)共有多態(tài)性變異位點(diǎn)41個(gè)，2個(gè)區(qū)域H-psbA與L-F的變異位點(diǎn)分別為39個(gè)和2個(gè)，區(qū)域H-psbA含有其中95.1%的變異位點(diǎn)，是老鷹茶植物葉綠體DNA間區(qū)中多態(tài)性較高的區(qū)域。H-psbA區(qū)域的核苷酸多樣性(Pi)為0.01892，平均核苷酸差異(k)為9.933；L-F區(qū)域的核苷酸多樣性(Pi)為0.00212，平均核苷酸差異(k)為0.933。H-psbA區(qū)域的單倍型數(shù)目(h)與單倍型多樣性(Hd)較高，分別為9個(gè)和0.978，但其單倍型多樣性方差(Vh)和單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差(Sh)較低，分別為0.00292和0.054；L-F區(qū)域的單倍型數(shù)目(h)與單倍型多樣性(Hd)較低，分別為2個(gè)和0.467，但其單倍型多樣性方差(Vh)和單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差(Sh)較高，分別為0.01736和0.132。

10份老鷹茶植物的2個(gè)葉綠體DNA間區(qū)組合之后的片段共有10個(gè)單倍型，其核苷酸多樣性(Pi)、平均核苷酸差異(k)、單倍型多樣性(Hd)、單倍型多樣性方差(Vh)和標(biāo)準(zhǔn)差(Sh)分別為0.01126、10.867、1.000、0.002、0.045。

2.4 Tajima’s檢測

對2個(gè)區(qū)域進(jìn)行Tajima’s測驗(yàn)，結(jié)果見表5，trnH-psbA區(qū)域中的Tajima’s D值是負(fù)值，為-1.35554，trnL-trnF區(qū)域中的Tajima’s D值是正值，為1.03299，2個(gè)區(qū)域均在P>0.10水平上不顯著。2個(gè)葉綠體DNA間區(qū)序列組合之后的Tajima’s D值為-1.21568，在P>0.10水平上不顯著，說明合并后的片段遵循中性進(jìn)化模型。

表5 10份老鷹茶植物葉綠體DNA片段的Tajima’s值

2.5 老鷹茶不同類型間遺傳關(guān)系

基于葉綠體DNA引物trnH-psbA與trnL-trnF擴(kuò)增出來的序列通過合并后進(jìn)行聚類分析，采用Neighbour-Joining(NJ)[11]的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2，黃芽株之間親緣關(guān)系較近，紅芽株之間親緣關(guān)系較近，白芽株與紅芽株、黃芽株之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但該方法并不能有效區(qū)別黃芽株之間的雌雄差異，聚類結(jié)果與傳統(tǒng)解剖學(xué)分類結(jié)果大致相同，說明此聚類結(jié)果可信。

圖2 10份老鷹茶植物基于NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

學(xué)者Feng等[6]通過對中國7個(gè)省區(qū)的23份豹皮樟進(jìn)行了trnH-psbA、trnL-trnF和trnT-trnL 3個(gè)葉綠體標(biāo)記進(jìn)行單倍體類型研究，本研究參考其方法，針對貴州省老鷹茶植物進(jìn)行引物驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)trnT-trnL區(qū)域測序結(jié)果出現(xiàn)重疊峰，因此本研究涉及到的葉綠體DNA區(qū)域?yàn)閠rnH-psbA與trnL-trnF。

在貴州省遵義市湄潭縣所收集的老鷹茶古樹樣本，測序后將trnH-psbA與trnL-trnF這2個(gè)葉綠體DNA區(qū)域合并后發(fā)現(xiàn)，有28個(gè)單一突變位點(diǎn)、13個(gè)簡約信息位點(diǎn)和11個(gè)插入-缺失位點(diǎn)，共計(jì)41個(gè)多態(tài)性變異位點(diǎn)，2個(gè)區(qū)域H-psbA與L-F的變異位點(diǎn)分別為39個(gè)和2個(gè)。區(qū)域H-psbA是老鷹茶植物葉綠體DNA間區(qū)中多態(tài)性較高的區(qū)域，變異位點(diǎn)占95.1%，包含28個(gè)單一突變位點(diǎn)、11個(gè)簡約信息位點(diǎn)和5個(gè)插入-缺失位點(diǎn)，可見區(qū)域H-psbA的突變類型主要表現(xiàn)為單一位點(diǎn)突變；區(qū)域L-F僅含2個(gè)簡約信息位點(diǎn)和6個(gè)插入-缺失位點(diǎn)，沒有單一突變位點(diǎn)，可見該區(qū)域突變類型主要表現(xiàn)為插入-缺失位點(diǎn)。通過計(jì)算得到貴州老鷹茶植物的葉綠體DNA核苷酸多樣性(Pi)為0.01126，單倍型多樣性(Hd)為1.000。在Tajima’s測驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，區(qū)域H-psbA與L-F在各檢驗(yàn)水平上均不顯著，說明這2個(gè)葉綠體DNA區(qū)域在進(jìn)化上遵循中性模型，在分子水平導(dǎo)致進(jìn)化的原因不是自然選擇，而是突變壓力和遺傳漂變。

貴州省遵義市湄潭縣老鷹茶葉綠體DNA序列與GenBank中的Actinodaphne lancifolia(登錄號為NC_045251.1)的朝鮮木姜子種的相似值達(dá)100%。將10份老鷹茶植物基于葉綠體DNA引物trnH-psbA與trnL-trnF擴(kuò)增出來的序列通過合并進(jìn)行聚類分析，采用Neighbour-Joining(NJ)[11]的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，能夠有效區(qū)分白芽株、紅芽株、黃芽株，但不能有效區(qū)分黃芽株之間的雌雄差異。在10份老鷹茶植物中，黃芽雄株2號(YM2)的聚類結(jié)果較為特殊，距離其他黃芽株都較遠(yuǎn)，距離白芽雄株更近，由于黃芽株是白芽株與紅芽株的后代，屬于雜合株，可能黃芽雄株2號(YM2)的父本優(yōu)勢較強(qiáng)而表現(xiàn)的，該部分猜想還需下一步試驗(yàn)來驗(yàn)證。