鄭明娜，董維亮，李延偉，張慶竹

(1.山東大學(xué) 環(huán)境研究院，山東 青島 266237；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800)

塑料是一種重要的有機高分子聚合物，具有質(zhì)量輕、耐腐蝕和價格低等優(yōu)良特性，已被廣泛應(yīng)用于日常生活的方方面面[1-3]。自20世紀(jì)以來，全球塑料產(chǎn)量急劇增加，僅2020年產(chǎn)量就達(dá)到了3.67億t[4]，環(huán)境中大量的塑料廢棄物對全球生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生了巨大威脅[2,5-7]。當(dāng)前塑料廢棄物主要通過填埋、焚燒、機械或化學(xué)回收等方法進行處理。填埋和焚燒的方法雖然可以快速處理混合廢舊塑料，但難以從根本上解決塑料污染問題[8]。機械回收具有操作簡單、投資少及對環(huán)境影響小等優(yōu)點，然而同時也存在回收種類有限、降級利用等問題[9-12]?；瘜W(xué)回收比機械回收應(yīng)用范圍更廣，但存在能耗高、二次污染等問題[11,13-15]。相比之下，塑料的生物解聚具有能耗低、綠色環(huán)保等優(yōu)點，逐漸受到人們的青睞。生物解聚技術(shù)的關(guān)鍵是在微生物或酶作用下的各類塑料解聚反應(yīng)[8,11,16-17]。

聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)是年生產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣泛的一類聚酯塑料。廢棄PET塑料約占全球固體廢棄物的12%，其生物解聚再利用是當(dāng)前研究的熱點[18-31]。自2005年首次報道PET的酶解聚成果以來，目前已經(jīng)證實TfH、TfCut2、LCC、Cut190、HiC和IsPETase等多種酶均具有解聚PET的能力[22-23,32-38]。然而，酶的催化效率低、熱穩(wěn)定性差和經(jīng)濟可行性等因素在一定程度上制約了PET生物解聚技術(shù)的推廣應(yīng)用[20,31,39]。近年來，科研工作者利用X線衍射等技術(shù)解析了TfCut2[40]、LCC[22,41-42]、IsPETase[24,43]、BurPL[23]、PET2[44]和RgPETase[45]等多個PET解聚酶的三維結(jié)構(gòu)，為深入理解PET的解聚機制并理性指導(dǎo)新酶的設(shè)計提供了重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

在實驗研究方法迅速發(fā)展的同時，理論計算方法也取得了較快的發(fā)展。理論計算的優(yōu)勢是能夠在分子層面研究解聚酶的動態(tài)性質(zhì)及解聚機制，并預(yù)測潛在的有益突變位點。當(dāng)前PET的酶催化解聚領(lǐng)域應(yīng)用較多的理論計算技術(shù)主要包括分子對接技術(shù)(molecular docking)、分子動力學(xué)模擬技術(shù)(molecular dynamics,MD)、量子化學(xué)計算技術(shù)(quantum chemistry)及多尺度模擬技術(shù)(multiscale modelling)等[22,43,46-54]，如Tournier等[22]采用分子動力學(xué)模擬技術(shù)闡釋了極具工業(yè)化前景的LCCICCG突變體高效解聚PET的原因，Li等[55]將分子動力學(xué)模擬與機器學(xué)習(xí)模型相結(jié)合顯著提升了TfCut2的解聚效率。圖1為筆者以“plastic & biodegrad* & enzyme*”為主題詞在Web of Science核心集搜索總結(jié)的近十年具有代表性PET解聚酶的鑒別、晶體解析以及工程化的文章出版情況。

圖1 最近十年具有代表性PET解聚酶的鑒別、晶體解析以及工程化的文章發(fā)表情況

本文綜述了理論計算在PET塑料生物酶解聚研究中的應(yīng)用進展，探討了相關(guān)研究中的不足與難點，并嘗試提出下一步的研究重點，以期理論計算在廢棄PET塑料乃至其他廢棄聚酯塑料的解聚再利用中發(fā)揮更大的作用。

1 理論計算

理論計算主要利用計算機模擬分子的結(jié)構(gòu)與行為，進而模擬分子體系的各種物理、化學(xué)性質(zhì)[56-61]。理論計算技術(shù)的發(fā)展有2個重要的里程碑：第一個里程碑是1998年諾貝爾獎授予了量子化學(xué)家Walter Kohn和John Pople，標(biāo)志著化學(xué)不再是純粹的實驗科學(xué)，而由此發(fā)展出來的密度泛函理論(DFT)方法已經(jīng)發(fā)展成為廣大化學(xué)家所使用的工具；第二個里程碑是2013年諾貝爾化學(xué)獎授予了理論化學(xué)家Martin Karplus、Michael Levitt以及Arieh Warshel，確立了多尺度模擬方法在模擬復(fù)雜大分子體系尤其是在模擬生物酶參與的催化反應(yīng)領(lǐng)域的重要地位[62-66]。按模擬精度，理論計算可以分為從頭算(ab initial)、DFT、半經(jīng)驗(semi-empirical)以及分子力學(xué)(molecular mechanics,MM)方法等，前三者均屬于量子力學(xué)方法(quantum mechanics,QM)。一般而言，在計算資源相同的情況下，精度越高的方法能夠研究的體系越小。當(dāng)前量子力學(xué)方法僅可以研究包含幾百個原子的體系，而分子力學(xué)方法可以研究包含上千萬個原子的超分子體系，覆蓋了當(dāng)前已知的所有生物酶(PET解聚酶含有約160個氨基酸，約4 000個原子)。

采用理論計算方法研究PET解聚酶催化解聚機制的常見流程主要包括分子對接、動力學(xué)模擬、多尺度模擬和數(shù)據(jù)分析等(圖2)。常用的理論計算方法優(yōu)缺點總結(jié)如下：第一，準(zhǔn)確的酶催化機制解析依賴精準(zhǔn)的酶三維結(jié)構(gòu)。當(dāng)前蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB)中的酶分子活性中心多不含底物分子。雖然有些蛋白結(jié)構(gòu)中包含了底物類似物，如Han等[24]已經(jīng)解析出含有PET類似物的IsPETase解聚酶晶體結(jié)構(gòu)，為酶理性設(shè)計提供了較好的結(jié)構(gòu)模板，然而需要指出的是，底物類似物與真實底物在結(jié)構(gòu)上存在一定的區(qū)別，這就導(dǎo)致兩者與酶的結(jié)合特征也將有所不同。分子對接技術(shù)可以快速且相對準(zhǔn)確地預(yù)測生物酶與真實底物之間的結(jié)合模式，是研究解聚酶催化機制的重要技術(shù)之一。第二，酶分子柔性大、構(gòu)象多，準(zhǔn)確模擬PET解聚酶的催化解聚機制需要盡可能多地考慮酶的各種構(gòu)象。分子動力學(xué)模擬可以在原子尺度上描述酶催化體系的動態(tài)性質(zhì)，是研究PET解聚酶催化機制的重要手段，其主要缺點是難以準(zhǔn)確描述酶催化反應(yīng)過程。第三，量子化學(xué)計算可以描述解聚酶催化反應(yīng)過程，構(gòu)建反應(yīng)勢能剖面，明確主要反應(yīng)通道與速度控制步驟，得到短壽命中間體的結(jié)構(gòu)、頻率和能量信息，而其主要缺點是處理的體系大小有限。第四，多尺度模擬技術(shù)結(jié)合了量子力學(xué)和分子力學(xué)的優(yōu)勢，采用量子力學(xué)方法描述發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的關(guān)鍵區(qū)域，采用分子力學(xué)方法描述活性區(qū)域周圍的環(huán)境，能夠有效地研究完整的酶分子的催化過程，已經(jīng)成為研究酶促反應(yīng)機制的主要方法之一。

圖2 理論計算方法研究PET解聚酶催化解聚機制常見流程

2 理論計算技術(shù)在塑料生物酶解聚中的應(yīng)用進展

2.1 分子對接技術(shù)應(yīng)用進展

目前，已經(jīng)解析出的PET解聚酶三維結(jié)構(gòu)中多沒有真實底物[24,41,43,67]，因而PET與其解聚酶之間的相互作用與結(jié)合模式是當(dāng)前研究的熱點之一。PET解聚酶與PET二聚體的對接模型見圖3。Fecker等[68]利用分子對接技術(shù)探索了PET二聚體(2-HE(MHET)2)與解聚酶IsPETase、TfCut2和LCC的結(jié)合模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PET與IsPETase結(jié)合更穩(wěn)定的根源在于IsPETase結(jié)合位點氨基酸殘基組成的獨特性，如IsPETase中I181的貢獻(xiàn)占全部結(jié)合能的12%，而LCC(Val)和TfCut2(Ile)中對應(yīng)位置的氨基酸貢獻(xiàn)較小。Liu等[69]采用分子對接技術(shù)揭示IsPETase較寬的底物結(jié)合口袋是其能夠高效降解PET的重要原因之一。Joo等[43]提出PET四聚體(2-HE(MHET)4)可以與IsPETase平坦疏水表面的一個“L”形淺裂縫完美結(jié)合，然而該研究中用到的四聚體皆定為trans-構(gòu)型，這一“假設(shè)”的合理性隨后被Wei等[70]所挑戰(zhàn)：核磁共振(NMR)分析結(jié)果表明常溫下PET塑料應(yīng)多以gauche-構(gòu)型存在(gauche-與trans-構(gòu)型的比例約為10∶1)。最近，Guo等[47]通過分子對接、動力學(xué)模擬等多種技術(shù)闡明了PET的構(gòu)象(trans-和gauche-構(gòu)型)組成會對解聚酶的解聚活性產(chǎn)生重要影響。除了PET自身結(jié)構(gòu)之外，解聚酶表面結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)組成也會影響酶的催化效率。分子對接技術(shù)可以確定并篩選出與PET結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，有針對地開展突變實驗可獲得解聚活性明顯提升的解聚酶突變體。如Son等[71]以PET四聚體(2-HE(MHET)4)為底物，將分子對接與結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)相結(jié)合，對IsPETase的結(jié)合位點進行優(yōu)化，得到了催化活性提升58倍的酶突變體。除IsPETase外，LCC、esterase和PHL7等解聚酶底物結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)特征也被解析[72-74]。

圖3 PET解聚酶與PET二聚體的對接模型

2.2 分子動力學(xué)模擬技術(shù)應(yīng)用進展

分子動力學(xué)模擬可以描述PET解聚酶在溶液中的動態(tài)變化。Chen等[49]發(fā)現(xiàn)，將兩性離子多肽鏈融合到IsPETase的C端可以顯著提高解聚酶的催化活性，并利用分子動力學(xué)模擬對其分子機制進行了解釋：計算結(jié)果表明兩性離子多肽鏈的引入造成了底物結(jié)合口袋處疏水氨基酸的暴露以及Y87殘基中苯環(huán)的旋轉(zhuǎn)，進而增強了對底物的親和力(圖4)。分子動力學(xué)模擬也可用于解釋氨基酸突變引起的PET解聚酶催化活性提升的機制。Pirillo等[75]通過分析突變體在有/無底物2種狀態(tài)下的分子動力學(xué)模擬過程，闡明了突變的氨基酸對周圍其他氨基酸殘基的形態(tài)存在影響，進而對酶催化活性的提升作出了合理的解釋。Cui等[46]通過晶體結(jié)構(gòu)和MD模擬對DuraPETase突變體進行分析后發(fā)現(xiàn)，多種有利突變之間的協(xié)同作用對酶穩(wěn)定性的提升具有重要影響，同時發(fā)現(xiàn)突變形成的“芳香通道”有助于酶與PET底物的結(jié)合，所以可通過增強活性位點對高結(jié)晶度PET底物的適應(yīng)性來提高解聚酶的解聚活性。分子動力學(xué)模擬不僅能解釋實驗現(xiàn)象，還能用于指導(dǎo)PET解聚酶的改性。如，Li等[55]將分子動力學(xué)模擬與機器學(xué)習(xí)模型相結(jié)合預(yù)測了氨基酸修飾對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響，成功獲得具有高Tm的TfCut2突變體，且在70 ℃時PET解聚效率提升了46.42倍。此外，分子動力學(xué)模擬技術(shù)在MHET水解酶的機制解析中也發(fā)揮了重要的作用。如，Peng等[76]利用分子動力學(xué)模擬技術(shù)深化了對含蓋結(jié)構(gòu)域α/β-水解酶IsMHETase構(gòu)象動力學(xué)的認(rèn)識，為開發(fā)工程化更高解聚效率的解聚酶提供了理論基礎(chǔ)。

圖4 MD模擬軌跡評估EKylated PETases的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[49]

2.3 量子化學(xué)計算技術(shù)應(yīng)用進展

量子化學(xué)計算(包括DFT方法等)能夠準(zhǔn)確描述體系的化學(xué)變化，是當(dāng)前研究酶催化反應(yīng)的常見技術(shù)之一[77-79]。Hu等[53]利用DFT方法研究了單核金屬蛋白酶(NEP)和絲氨酸蛋白酶(CLE)解聚PET的分子機制后發(fā)現(xiàn)：這2種酶解聚PET的機制完全不同，其中，單核金屬蛋白酶可以利用金屬結(jié)合的羥基進攻機制(MH)催化PET解聚——酶活性中心鋅原子激活水分子，引發(fā)親核進攻反應(yīng)，繼而完成整個催化過程；絲氨酸解聚酶則通過催化三聯(lián)體(Ser85-His180-Asp165)主導(dǎo)的?；兔擋；?個連續(xù)的反應(yīng)過程催化PET解聚。DFT計算結(jié)果證實單核金屬蛋白酶(38.09 kJ/mol)催化PET的解聚效率比絲氨酸解聚酶(93.77 kJ/mol)高，表明單核金屬蛋白酶金屬活性中心鋅原子的親核活化作用比絲氨酸解聚酶催化三聯(lián)體提供的氫鍵網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定作用更有效。此外，DFT方法還可以探究酶與底物之間的相互作用。Feng等[51]和Zheng等[54]應(yīng)用DFT方法分別研究了解聚酶IsPETase、LCCICCG與底物之間的擾動和相互作用能(圖5)，闡明了酶催化PET解聚過程中酶自身結(jié)構(gòu)的擾動能變化以及與底物之間相互作用的特征，為合理設(shè)計更高催化效率的PET解聚酶提供了思路。該研究提出了決速步比值ΔEint/ΔEdis的概念：對于同樣的反應(yīng)過程，比值越大意味著酶進化得越完美、突變潛力越小。他們發(fā)現(xiàn)，LCCICCG的決速步比值雖然較高(0.90)，但仍有繼續(xù)提升的空間。盡管Boneta等[52]基于實驗結(jié)果認(rèn)為，LCCICCG突變體水解酶的高活性主要歸因于溫度因素，但Lu等[31]通過機器學(xué)習(xí)方法突變得到的FAST-PETase在50 ℃下對PET的解聚效率要高于LCC和LCCICCM在70 ℃下的解聚效率，說明氨基酸突變引起酶內(nèi)部結(jié)構(gòu)相互作用力(氫鍵、鹽橋等)的改變也可以在一定程度上提高酶的解聚效率。因此，通過改變酶自身結(jié)構(gòu)以及與底物之間的相互作用力也是提升PET解聚酶解聚效率的途徑之一。

紅色箭頭表示活性位點氨基酸的過渡態(tài)與反應(yīng)物/中間體之間的擾動能差；黃色箭頭為底物的擾動能差；綠色箭頭為過渡態(tài)與反應(yīng)物/中間體的相互作用能差；黑色箭頭表示計算出的能壘

2.4 多尺度模擬技術(shù)應(yīng)用進展

多尺度模擬已經(jīng)成為研究塑料解聚酶促反應(yīng)的有效手段。Jerves等[48]采用傘形抽樣方法在PBE/MM MD水平下研究了解聚酶IsPETase解聚PET的機制后指出，IsPETase解聚過程包括酰化和脫?；?個階段，對應(yīng)的能壘分別為83.72和63.21 kJ/mol。Boneta等[52]采用傘形抽樣方法在AM1/MM MD水平下模擬發(fā)現(xiàn)：IsPETase和LCC催化PET解聚需要經(jīng)過4個協(xié)同的反應(yīng)過程，即絲氨酸引起的親核進攻反應(yīng)、底物的C—O鍵斷裂、水分子引發(fā)的親核進攻反應(yīng)、?；钢虚g體的C—O鍵斷裂。根據(jù)LCCICCG和IsPETase能壘和水解反應(yīng)熱力學(xué)的對比結(jié)果可以認(rèn)為，LCCICCG較高的解聚效率主要歸因于高溫下酶與底物親核進攻反應(yīng)更容易發(fā)生，并通過對比解聚酶IsPETase和LCCICCG催化PET二聚體(2-HE(MHET)2)反應(yīng)過程中的結(jié)構(gòu)變化，揭示了2種重要PET解聚酶之間的差異性。此外，Chen等[80]采用QM/MM水平下的Metadynamics方法也證實了T.fusca角質(zhì)酶催化解聚機制的?；兔擋；?個半反應(yīng)可以進一步劃分為4個協(xié)同的反應(yīng)過程。

酶催化單分子實驗(同一個酶分子催化同一種底物)測得的酶催化周轉(zhuǎn)速率常數(shù)不是一個恒定的值，而是對應(yīng)著較長的時間范圍(10-3～102s)[81-82]，這意味著宏觀實驗測得的恒定催化速率(kcat值)只是多個酶分子催化反應(yīng)系綜平均后的結(jié)果[23,32,44-45]。根據(jù)艾林方程，如此大的波動意味著同一酶分子所處的狀態(tài)不同時，其催化同一種底物對應(yīng)的能壘差值可達(dá)25.12 kJ/mol?？紤]多個酶分子構(gòu)象，采用高水平多尺度模擬方法將能在一定程度上體現(xiàn)這一波動。Feng等[51]和Zheng等[54]從長時間動力學(xué)中隨機選取20個解聚酶IsPETase和LCC構(gòu)象，在M06-2X/6-311G(d,p)∥CHARMM高精度計算水平下獲得了相關(guān)的能量信息(圖6)，計算結(jié)果表明IsPETase和LCC解聚PET二聚體時的決速步的能壘波動范圍分別為51.07～149.02和50.23～102.56 kJ/mol。通過采用玻爾茲曼平均方法進一步估算了酶催化反應(yīng)的能壘(58.19和56.93 kJ/mol)，結(jié)果與實驗值吻合較好。通過構(gòu)建活性區(qū)域關(guān)鍵特征(電荷、結(jié)構(gòu))與反應(yīng)能壘之間的線性關(guān)系，確定了影響酶解聚效率的關(guān)鍵參數(shù)。此外，多尺度計算模擬PET解聚酶的催化反應(yīng)過程將有助于高效解聚酶的理性設(shè)計。Jerves等[48]深入分析了決速步反應(yīng)物和過渡態(tài)的電荷分布后發(fā)現(xiàn)，帶電殘基Asp83、Asp89和Asp159會提升PET解聚反應(yīng)能壘，因而提出將三者突變?yōu)橹行园被峥赡軙嵘齀sPETase的解聚效率。

圖6 IsPETase催化PET的解聚過程(a)[51]以及 IsPETase和LCC催化PET解聚反應(yīng)的能壘(b)[51,54]

3 結(jié)論與展望

隨著環(huán)境中塑料廢棄物呈指數(shù)倍增加，對塑料廢棄物的高效解聚與回收再利用已迫在眉睫。理論計算技術(shù)作為一項強有力的研究手段，可以獲得酶分子與底物的結(jié)合方式、酶分子構(gòu)象變化、關(guān)鍵氨基酸對酶催化性質(zhì)的影響等信息，已經(jīng)在PET塑料生物酶解聚機制挖掘、高效解聚酶設(shè)計中發(fā)揮了一定的作用。然而，相關(guān)研究依然處于相對初級的階段，仍有許多關(guān)鍵問題待解決：1)PET塑料分子本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存在結(jié)晶區(qū)、無定形區(qū)等，已有研究表明解聚酶對不同結(jié)晶度的塑料的解聚效率有明顯區(qū)別。在當(dāng)前理論計算研究中，PET塑料多采用小分子寡聚體(如二聚體、四聚體)模型化合物代替，難以準(zhǔn)確描述生物酶在塑料超分子表面的吸附和催化行為。2)解聚酶催化全過程模擬研究尚存不足，下一步可以采用統(tǒng)一的計算水平研究解聚酶吸附在PET塑料表面的結(jié)合全過程、催化全過程、產(chǎn)物釋放全過程。注重探索結(jié)合全過程、產(chǎn)物釋放全過程是否需要跨越能壘，從酶催化全過程的角度判斷影響酶催化速率的關(guān)鍵步驟，從而有針對性地發(fā)展酶突變體快速篩選及預(yù)測技術(shù)。3)在現(xiàn)有服務(wù)器計算能力下，理論計算技術(shù)在面向超大體系時的計算模擬效率依然有待提升。相信隨著大數(shù)據(jù)技術(shù)、人工智能等方法的不斷深化與普及，其與理論計算技術(shù)的深度結(jié)合也必將深化理論計算在塑料生物酶解聚中的應(yīng)用，為我國塑料廢棄物的回收利用做出更大貢獻(xiàn)。