辛開元，何美霖,羅云鵬,劉豪杰，周 杰,3，錢秀娟，董維亮,3

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院 廢塑料生物催化解聚與循環(huán)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 2011學(xué)院，江蘇 南京 211800；3.南京工業(yè)大學(xué) 材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211800)

廢棄塑料化學(xué)解聚和生物解聚產(chǎn)物多為小分子酸/醇等的混合體系，存在分離困難、附加值低、難以再加工等不足[1-2]。若能結(jié)合合成生物學(xué)技術(shù)與發(fā)酵工程技術(shù)將廢棄塑料單體進(jìn)行高值轉(zhuǎn)化，發(fā)展未來發(fā)酵行業(yè)新的原料替代方案，這對(duì)于提升塑料回收過程的經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益都具有重要意義[3-4]。

小分子二元醇是很多廢棄塑料生物解聚后的單體成分，乙二醇(EG)作為PET塑料的主要解聚物之一，解析其微生物代謝機(jī)制、建立生物基產(chǎn)品合成路徑是近年來EG高值化回收的熱點(diǎn)研究路線[5-8]。2012年，Mückschel等[9]通過適應(yīng)性進(jìn)化篩選獲得了可以利用EG的突變菌PseudomonasputidaJM37，并首次解析了EG微生物代謝機(jī)制。EG首先在周質(zhì)吡咯并喹啉醌(PQQ)依賴性酶(PedE、PedH)的催化下轉(zhuǎn)化為乙醇醛(glycolaldehyde，GA)，接著在胞質(zhì)醛脫氫酶PP_0545和PedI的作用下生成乙醇酸，繼而在膜錨定的乙醇酸氧化酶GlcDEF的作用下生成乙醛酸。理論上，乙醛酸可以通過乙醛酸循環(huán)結(jié)合乙酰輔酶A生產(chǎn)蘋果酸進(jìn)而進(jìn)入檸檬酸循環(huán)，但在P.putida模式菌株KT2440中，乙酰輔酶A的供給不足導(dǎo)致乙二醇無法作為菌株培養(yǎng)的唯一碳源。在突變菌P.putidaJM37中，乙醛酸可以通過誘變激活途徑——乙醛酸醛連接酶(glyoxylate carboligase，GCL)途徑，在GCL催化下生成酒石酸半醛，隨后在羥基丙酮酸異構(gòu)酶(Hyi)和酒石酸酯半醛還原酶(GlxR)的作用下生成甘油酸，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為2-磷酸甘油酸進(jìn)入糖酵解途徑，轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。一部分乙酰輔酶A直接進(jìn)入檸檬酸循環(huán)，另一部分則與前期代謝中間產(chǎn)物乙醛酸縮合生成蘋果酸，通過乙醛酸途徑進(jìn)入檸檬酸循環(huán)。因此，突變菌P.putidaJM37可以利用EG作為唯一碳源生長(zhǎng)，但利用能力仍非常低下?；贓G同化分子機(jī)制的研究基礎(chǔ)，F(xiàn)randen等[5]通過過量表達(dá)hyi、glxR、ttuD和pykF等基因，在P.putidaKT2440中構(gòu)建了用于EG代謝的GCL途徑，實(shí)現(xiàn)了P.putidaKT2440對(duì)EG的快速利用，但由于GCL途徑和TCA循環(huán)的碳損失量巨大，導(dǎo)致EG為發(fā)酵底物轉(zhuǎn)化合成產(chǎn)物如聚羥基脂肪酸(PHA)的碳得率非常低，只有0.06 g/L。

GCL途徑促進(jìn)EG利用的主要原因可能是為菌株的代謝提供了乙酰輔酶A來源。乙酰輔酶A不足，EG代謝中間產(chǎn)物乙醛酸無法進(jìn)一步轉(zhuǎn)化，同時(shí)乙酰輔酶A也是重要的初級(jí)代謝產(chǎn)物，參與微生物的多種代謝活動(dòng)[10]。因此，若能利用乙酰輔酶A直接前體如乙酸(AC)作為碳源進(jìn)行共底物發(fā)酵，或?qū)⒂行岣逧G的微生物轉(zhuǎn)化效率。

P.putidaKT2440是GRAS認(rèn)證環(huán)境安全的假單胞菌屬模式菌種[11]，遺傳背景清晰，產(chǎn)物的生物合成過程不受細(xì)胞群體感應(yīng)的影響，并且具有出色的降解環(huán)境污染物以及在惡劣條件下的強(qiáng)大生存能力，是生物修復(fù)、代謝工程和生物催化的理想細(xì)胞底盤[12-14]。本研究選用P.putidaKT2440為底盤，通過設(shè)計(jì)EG-AC共底物發(fā)酵策略，并構(gòu)建單鼠李糖脂(mono-RL)合成途徑，建立EG完全同化合成mono-RL生物路線，以期為塑料解聚產(chǎn)物的生物法高值再造提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究中使用的底盤菌株P(guān).putidaKT2440由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)崔中利教授提供，鼠李糖脂合成菌株P(guān).aeruginosaPAO1、P.aeruginosaKT1115和質(zhì)粒pBBRmcs-5，保藏于南京工業(yè)大學(xué)廢塑料生物催化解聚與循環(huán)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；自制鼠李糖脂標(biāo)樣。

1.1.2 培養(yǎng)基和主要試劑的配制

基礎(chǔ)LB 液體培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 10.0、蛋白胨 10.0、酵母粉 5.0。在 121 ℃條件下高壓滅菌 15 min，用作遺傳改造篩選培養(yǎng)基以及種子培養(yǎng)。

M9培養(yǎng)基(g/L)：NaNO37.7、NaCl 1.0、KCl 0.1、CaCl20.01、KH2PO43.5、Na2HPO43.5、MgSO40.26、FeSO40.001。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求添加碳源，利用2 mol/L NaOH和2 mol/L HCl調(diào)節(jié)初始pH為7.0。

菜籽油培養(yǎng)基(g/L)：菜籽油 60.0、NaNO37.7、NaCl 1.0、KCl 0.1、CaCl20.01、KH2PO43.5、Na2HPO43.5、MgSO40.26、FeSO40.001、酵母粉 0.5、FeCl30.08、ZnSO40.75、CuSO40.075、MnSO40.75、H3BO30.15。利用2 mol/L NaOH和2 mol/L HCl調(diào)節(jié)初始pH為7.0。

硝酸鹽培養(yǎng)基(g/L)：NaNO36.0、酵母膏3.0、KH2PO41.0、Na2HPO41.0、CaCl2·2H2O 0.1、MgSO40.1。據(jù)實(shí)驗(yàn)需求添加碳源，利用2 mol/L NaOH和2 mol/L HCl調(diào)節(jié)初始pH為7.0。

1.2 方法

1.2.1 微生物利用EG情況

將-80 ℃保存的P.putidaKT2440接種至5 mL LB試管，置于30 ℃、180 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)12 h，按1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，按10%接種量接種于含50 mL M9培養(yǎng)基的搖瓶中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要添加不同濃度的EG或EG與AC共底物作為碳源，發(fā)酵過程每24 h取樣測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)、底物消耗與代謝中間產(chǎn)物積累情況。

1.2.2 EG與GA的細(xì)胞毒性分析

LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)的P.putidaKT2440按1%接種量接種至20 mmol/L葡萄糖為碳源的M9培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的EG(0、20、40、60和80 mmol/L)和GA(0、2、4、6和8 mmol/L)，通過對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況的檢測(cè)，分析EG和GA的細(xì)胞毒性。

1.2.3 Mono-RL合成菌株構(gòu)建

以銅綠假單胞菌P.aeruginosaPAO1和P.aeruginosaKT1115基因組為模板，設(shè)計(jì)引物rh1IRBA-F:5-C￣C￣C￣G￣T￣C￣C￣T￣G￣T￣G￣A￣A￣A￣T￣C￣T￣G￣G￣C￣A-3′，rh1IRBA-R:5′-G￣A￣G￣C￣A￣T￣G￣C￣G￣G￣C￣A￣G￣G￣A￣G￣A￣A￣G￣C￣G-3′，擴(kuò)增mono-RL合成基因簇rh1IRBA，對(duì)克隆的片段進(jìn)行測(cè)序無誤后，利用一步克隆引物rh1IRBA-F′:5′-G￣A￣C￣T￣C￣A￣C￣T￣A￣T￣A￣G￣G￣G￣C￣G￣A￣A￣T￣T￣G￣G￣A￣G￣C￣T￣C￣C￣C￣G￣T￣C￣C￣T￣G￣T￣G￣A￣A￣A￣T￣C￣T￣G￣G￣C￣A-3′，rh1IRBA-R′:5′-C￣G￣G￣T￣A￣T￣C￣G￣A￣T￣A￣A￣G￣C￣T￣T￣G￣A￣T￣A￣T￣C￣G￣A￣A￣T￣T￣C￣G￣A￣G￣C￣A￣T￣G￣C￣G￣G￣C￣A￣G￣G￣A￣G￣A￣A￣G￣C￣G-3′，對(duì)回收片段進(jìn)行二次擴(kuò)增(rh1IRBA-F′引物5′端引入pBBRmcs-5質(zhì)粒SacⅠ酶切位點(diǎn)上游26 bp作為一步克隆用同源臂，rh1IRBA-R引物5′端引入pBBRmcs-5質(zhì)粒EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)下游28 bp作為一步克隆用同源臂)。

表達(dá)載體pBBRmcs-5 經(jīng)SacⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，與2種不同來源rh1IRBA基因片段通過一步克隆連接獲得pBBRmcs-5-rh1IRBA-1(來源于P.aeruginosaPAO1)和pBBRmcs-5-rh1IRBA-2質(zhì)粒(來源于P.aeruginosaKT1115)，電轉(zhuǎn)化至P.putidaKT2440中，感受態(tài)細(xì)胞在30 ℃、200 r/min搖床孵育1 h后，稀釋涂布在含30 μg/L的慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基上，30 ℃過夜培養(yǎng)獲得重組菌株P(guān).putidaKT2441(來源于P.aeruginosaPAO1)和P.putidaKT2442(來源于P.aeruginosaKT1115)。

1.2.4 EG、AC、GA濃度測(cè)定

EG濃度測(cè)定：將適當(dāng)稀釋后的0.1 mL發(fā)酵液加入1 mL乙腈中，添加0.3 g無水Na2SO4用于去除發(fā)酵液中水分，振蕩混勻后，靜置吸取上層有機(jī)相，并通過濾膜過濾，濾液用于氣相色譜分析，檢測(cè)條件：140 ℃維持5 min后，以4 ℃/min升溫至230 ℃并維持8 min，分流比為100∶1的He作為載氣，進(jìn)樣口溫度為260 ℃。

AC濃度測(cè)定：1.5 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min，上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，經(jīng)濾膜過濾，用于高效液相色譜分析。流動(dòng)相為0.25 g/L 稀H2SO4，檢測(cè)條件為柱溫55 ℃、流速1 mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm。

GA濃度測(cè)定：利用酚試劑能與酚類和醛類化合物反應(yīng)生成有色化合物的原理對(duì)GA進(jìn)行檢測(cè)[15]。將15 μL 10 g/L的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽水合物與75 μL甘氨酸-HCL緩沖液混合，并加入10 μL發(fā)酵上清液形成衍生物1，取100 μL所得待測(cè)樣品加入750 μL FeCl3溶液以及150 μL去離子水形成衍生物2，測(cè)定其在630 nm處的吸光值，根據(jù)GA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中的GA含量。

1.2.5 發(fā)酵液中mono-RL的提取、定性與定量檢測(cè)

發(fā)酵液在4 ℃、10 000 r/min離心20 min，保留上清液，調(diào)節(jié)pH至1.5，于4 ℃冰箱放置12 h后，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，保留沉淀，并用pH 2.0的鹽酸溶液重復(fù)洗滌沉淀3次。隨后，用3 mL氯仿-乙醇溶液(體積比為2∶1)對(duì)沉淀重復(fù)萃取3次，合并收集的有機(jī)相，經(jīng)冷凍干燥后獲得的粉末即為mono-RL粗提物，用于薄層色譜法(TLC)分析。

TLC定性檢測(cè)：將mono-RL粗提物溶于乙酸乙酯，取5 μL溶液點(diǎn)在TLC硅膠板上。對(duì)照組為單雙鼠李糖脂混合物，展開劑為氯仿-甲醇-乙酸(三者的體積比為65∶15∶2)，顯色劑為80%(體積分?jǐn)?shù))的濃H2SO4。將干燥的硅膠板在80 ℃下孵育30 min 后測(cè)定比移值(Rf)。

質(zhì)譜分析(MS)：分離純化后的mono-RL樣品溶于甲醇溶液，制備成1 mg/mL的RLs甲醇溶液。檢測(cè)流動(dòng)相由A相(甲酸-甲醇溶液(體積比為1∶1 000))和B相(甲酸-乙腈溶液(體積比為1∶1 000))組成，流速為0.3 mL/min、柱溫為30 ℃、進(jìn)樣量為0.3 μL，使用電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)對(duì)RLs進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，分析條件為陰離子模式、毛細(xì)管電壓3.5 kV、裂解電壓50 V、N2作為脫溶氣體，掃描范圍為50～1 000m/z。

采用蔥酮硫酸法定量測(cè)定mono-RL產(chǎn)量∶精確稱取0.2 g 蒽酮溶于100 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的濃H2SO4中，獲得蒽酮硫酸溶液。取0.5 mL適當(dāng)稀釋后的發(fā)酵上清液在冰水浴中加入2 mL蒽酮硫酸溶液，使其充分混合后在沸水浴中反應(yīng)10 min，再將反應(yīng)體系放入冰水浴冷卻至室溫。利用酶標(biāo)儀測(cè)試反應(yīng)液吸光度，吸收波長(zhǎng)為620 nm，基于蔥酮硫酸法測(cè)定的鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算mono-RL濃度(ng/L)，空白組為蒸餾水。鼠李糖分子量為164，本研究發(fā)酵所獲得的單鼠李糖脂經(jīng)質(zhì)譜測(cè)定主要為Rha-C10-C10，分子量為503，mono-RL質(zhì)量濃度ρ(g/L)的換算公式為ρ=503n/164(g/L)(n為稀釋倍數(shù))。

2 結(jié)果與分析

2.1 P. putida KT2440對(duì)不同濃度EG利用情況

以不同濃度EG為唯一碳源培養(yǎng)P.putidaKT2440，結(jié)果見圖1(a)。由圖1(a)可知：在發(fā)酵前期，有10～20 mmol/L的EG被迅速消耗，菌株生物量有不同程度的增加。當(dāng)EG起始濃度為60 mmol/L時(shí)，P.putidaKT2440在培養(yǎng)24 h左右，OD600從接種時(shí)的0.37增長(zhǎng)到0.65。但在24 h后，底物不再被消耗且細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。

圖1 不同濃度的EG利用情況及代謝物質(zhì)細(xì)胞毒性分析

EG及其代謝中間產(chǎn)物GA具有一定的細(xì)胞毒性[16-17]，底物和中間代謝物的細(xì)胞毒性可能是導(dǎo)致EG無法被繼續(xù)生物利用的原因之一。因此，考察發(fā)酵過程中GA的累積情況，結(jié)果見圖1(a)。由圖1(a)可知：在發(fā)酵前期GA迅速積累，當(dāng)EG濃度分別為60和80 mmol/L時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后GA積累量最高分別可達(dá)4.3和5.4 mmol/L。

為進(jìn)一步考察EG和GA對(duì)P.putidaKT2440的細(xì)胞毒性，考察不同濃度EG和GA對(duì)菌株利用葡萄糖的影響，結(jié)果見圖1(b)和(c)。由圖1(b)和(c)可知：不同EG添加量對(duì)于菌體利用葡萄糖生長(zhǎng)速率沒有明顯抑制現(xiàn)象，表明EG無顯著的細(xì)胞毒性。不同GA添加量對(duì)于菌體利用葡萄糖生長(zhǎng)影響顯著，當(dāng)GA添加量大于6 mmol/L時(shí)，菌株生長(zhǎng)最高OD600值降低20%，當(dāng)GA添加量達(dá)到8 mmol/L時(shí)，菌株生長(zhǎng)被完全抑制(圖1(c))，表明GA的細(xì)胞毒性強(qiáng)大。然而，EG代謝過程中GA的最高積累僅為5.4 mmol/L，未達(dá)到細(xì)胞最低抑制濃度，由此可見EG和GA的細(xì)胞毒性并非導(dǎo)致EG無法繼續(xù)利用的關(guān)鍵。

2.2 P. putida KT2440利用EG與乙酸共碳源生長(zhǎng)情況

基于前期對(duì)EG代謝途徑的分析發(fā)現(xiàn)，乙酰輔酶A供給不足可能是EG無法被微生物持續(xù)利用的主要原因。因此，本研究利用乙酸作為乙酰輔酶A的直接供體，以期通過底物共發(fā)酵為EG利用提供充足的乙酰輔酶A，結(jié)果見圖2。

圖2 P. putida KT2440利用EG與乙酸共底物發(fā)酵考察

由圖2可知：60 mmol/L EG與60 mmol/L 乙酸共底物發(fā)酵時(shí)，乙酸消耗迅速，24 h內(nèi)被完全耗盡，發(fā)酵96 h后，80%的EG被消耗，與EG為唯一碳源相比，其利用率提高1.5倍。當(dāng)60 mmol/L EG與80 mmol/L 乙酸共底物發(fā)酵時(shí)，EG在96 h時(shí)被完全消耗，搖瓶細(xì)胞OD600最高可達(dá)2.6。由此可見，與乙酸共底物發(fā)酵可以激活EG的利用途徑。共底物培養(yǎng)發(fā)酵過程調(diào)控是強(qiáng)化微生物利用頑固底物的常用策略[18-19]，乙酸是木質(zhì)纖維素水解、合成氣發(fā)酵、有機(jī)廢棄物的厭氧消化等過程的產(chǎn)物或副產(chǎn)物，廣泛的來源成為多種微生物發(fā)酵的理想原料[20-23]，因此建立EG與乙酸的共底物發(fā)酵體系具有良好的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。乙酸濃度進(jìn)一步提高也對(duì)細(xì)胞造成了一定的毒性影響，在120 mmol/L乙酸濃度下細(xì)胞的生長(zhǎng)速率比100 mmol/L時(shí)的降低50%。最終根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)和底物消耗確定60 mmol/L EG與80 mmol/L 乙酸作為最優(yōu)共底物比例。

2.3 P. putida KT2440合成鼠李糖脂重組菌株構(gòu)建

P.aeruginosaPAO1和P.aeruginosaKT1115是鼠李糖脂合成的常用菌株，分別克隆其鼠李糖脂合成基因線路rhlIRBA并組裝至P.putidaKT2440中，獲得重組菌株P(guān).putidaKT2441和P.putidaKT2442。以菜籽油為底物發(fā)酵120 h，考察合成鼠李糖脂重組菌株的性能，結(jié)果見圖3。由圖3可知：P.putidaKT2441最高OD600可達(dá)1.49，合成鼠李糖脂產(chǎn)量為5.35 g/L，菜籽油消耗22.17 g/L，鼠李糖脂得率為0.24 g/g；P.putidaKT2442最高OD600可達(dá)1.65，合成鼠李糖脂產(chǎn)量為6.56 g/L，菜籽油消耗25.68 g/L，鼠李糖脂得率為0.26 g/g，表明P.putidaKT2442具有更強(qiáng)的鼠李糖脂合成能力。

圖3 重組菌株P(guān). putida KT2441和P. putida KT2442產(chǎn)鼠李糖脂發(fā)酵結(jié)果

受銅綠假單胞菌合成綠膿素和嚴(yán)重產(chǎn)泡現(xiàn)象的影響，近年來，通過在惡臭假單胞菌中構(gòu)建鼠李糖脂合成線路，實(shí)現(xiàn)鼠李糖脂的定向、高效合成獲得廣泛關(guān)注。2008年，Cha等[24]通過異源整合高產(chǎn)表面活性劑PseudomonasaeruginosaEMS1的鼠李糖脂合成基因線路，實(shí)現(xiàn)重組菌P.putida1067(pNE2)鼠李糖脂合成產(chǎn)量達(dá)6.97 g/L。2020年，Tiso等[25]通過在P.putidaKT2440中整合鼠李糖脂合成線路，耦合泡沫循環(huán)利用策略，鼠李糖脂產(chǎn)量達(dá)1.5 g/L。同年，Raza等[26]以廢棄煎炸油為碳源，對(duì)鼠李糖脂合成惡臭假單胞菌重組菌進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，鼠李糖脂最高產(chǎn)量達(dá)4.1 g/L。相較而言，本研究獲得的重組菌P.putidaKT2442鼠李糖脂合成能力強(qiáng)大，應(yīng)用前景廣闊。分析P.aeruginosaPAO1和P.aeruginosaKT1115來源的鼠李糖脂合成基因差異發(fā)現(xiàn)，基因組中負(fù)責(zé)調(diào)控rhlIRBA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子RhlI存在3個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)，HAAs合成酶RhlA存在一個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)[27]，這些氨基酸的差異可能導(dǎo)致鼠李糖脂合成相關(guān)酶的活性存在差異，進(jìn)而影響鼠李糖脂的合成效率。

2.4 EG與乙酸共底物發(fā)酵合成鼠李糖脂

P.putidaKT2442以60 mmol/L EG和80 mmol/L乙酸共底物發(fā)酵，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：利用M9培養(yǎng)基發(fā)酵24 h 后乙酸被完全消耗，細(xì)胞生物量達(dá)到最大值1.71 g/L，120 h后EG被完全消耗，細(xì)胞生物量逐漸降低到0.71 g/L，鼠李糖脂最終產(chǎn)量為0.29 g/L，得率為3.45%(圖4(a))；當(dāng)利用以NaNO3為氮源的硝酸鹽培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)和底物消耗趨勢(shì)與M9培養(yǎng)基相當(dāng)，而鼠李糖脂最終產(chǎn)量可達(dá)0.46 g/L，得率為0.055 g/g(圖4(b))，比M9培養(yǎng)基的結(jié)果提升顯著，表明氮源發(fā)酵調(diào)控可有效促進(jìn)鼠李糖脂的生物合成。

圖4 P. putida KT2442利用EG與AC共底物發(fā)酵合成鼠李糖脂

進(jìn)一步對(duì)合成的鼠李糖脂產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，結(jié)果見圖4(c)和(d)。由圖4(c)可知：對(duì)照組為單/雙鼠李糖脂混合物，單雙鼠李糖脂的Rf值分別為0.75和0.28；而P.putidaKT2442利用共碳源合成的產(chǎn)物成分單一，Rf值為0.758，與mono-RL的Rf值一致。由圖4(d)可知：產(chǎn)物的質(zhì)譜分析顯示只有1個(gè)高強(qiáng)度的離子峰503.3m/z，與mono-RL(Rha-C10-C10)理論分子量(503)一致，其他峰值占比非常低，可能為不同脂肪鏈長(zhǎng)度的mono-RL。

目前，市售的鼠李糖脂產(chǎn)品多為P.aeruginosa發(fā)酵合成，由于糖基數(shù)和脂肪酸鏈差異多為不同結(jié)構(gòu)的混合物，如P.aeruginosaKT1115合成鼠李糖脂為單糖基和雙糖基的混合物[28]。本研究構(gòu)建的重組菌株P(guān).putidaKT2442，只引入了mono-RL合成線路，實(shí)現(xiàn)了以EG與乙酸共底物合成結(jié)構(gòu)單一的mono-RL(Rha-C10-C10)，簡(jiǎn)化了下游分離與純化工藝，合成過程經(jīng)濟(jì)效益高。此外，mono-RL具有優(yōu)異的親油特性和乳化活性，因此其在提高疏水性有機(jī)污染物的生物可利用性、乳化驅(qū)油等方面應(yīng)用前景廣闊[29]。

3 結(jié)論

乙酰輔酶A不足是EG難以作為唯一發(fā)酵碳源的主要原因。通過與乙酸共底物發(fā)酵可以強(qiáng)化EG的生物利用，當(dāng)EG與乙酸濃度比為3∶4時(shí)，EG在96 h時(shí)被完全消耗，細(xì)胞OD600最高可達(dá)2.6。進(jìn)一步引入P.aeruginosa來源的mono-RL合成基因線路rh1IRBA，重組菌株P(guān).putidaKT2442利用菜籽油合成鼠李糖脂產(chǎn)量為6.56 g/L，得率為0.26 g/g。重組菌株P(guān).putidaKT2442利用EG與乙酸共底物發(fā)酵，鼠李糖脂最終產(chǎn)量0.46 g/L，得率0.055 g/g，產(chǎn)物鑒定為mono-RL(Rha-C10-C10)，結(jié)構(gòu)單一，下游分離與純化工藝簡(jiǎn)單。結(jié)合合成生物學(xué)技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)，設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)塑料解聚物到高值化學(xué)品的轉(zhuǎn)化路線，發(fā)展未來發(fā)酵行業(yè)的原料替代方案，對(duì)于經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展意義重大。