楊 芳,易雪晴,張忠楠,陳國(guó)強(qiáng),吳 瓊

(清華大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100083)

塑料是人造長(zhǎng)鏈聚合物，具有成本低、便攜、質(zhì)輕、導(dǎo)熱系數(shù)小、化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，其使用量逐年增加，成為人類(lèi)生產(chǎn)和生活不可或缺的重要基礎(chǔ)材料。據(jù)評(píng)估，全球每年生產(chǎn)3.68億t塑料，預(yù)計(jì)到2050年增加到近10億t(https:∥seedscientific.com/plastic-waste-statistics/)。廢棄塑料垃圾通常被填埋或焚燒，由于塑料制品的持久性和耐降解性，其在自然環(huán)境下很難被降解，填埋會(huì)對(duì)土地造成“白色污染”，焚燒則排放大量CO2造成溫室效應(yīng)[1]。此外，全球每年約有800萬(wàn)t塑料進(jìn)入海洋，導(dǎo)致海洋生物因吞食大量塑料廢棄物而死亡[2]，這些塑料顆粒也會(huì)通過(guò)海產(chǎn)品富集被人類(lèi)攝入。近期荷蘭的一項(xiàng)研究首次在人體血液中發(fā)現(xiàn)了微塑料顆粒，表明這些顆粒可以在體內(nèi)傳播，可能威脅人類(lèi)健康[3]。若不采取任何措施，到2040年，預(yù)計(jì)每年流入海洋的塑料將增加近3倍，達(dá)2 900萬(wàn)t，相當(dāng)于全球海岸線(xiàn)每米有50 kg塑料(圖1)；到2050年，僅塑料制造業(yè)就將消耗約占全球石油能源的20%[4]，而每年產(chǎn)生的CO2排放將達(dá)到65億t[5]。塑料污染日益加劇，塑料垃圾引發(fā)的環(huán)境問(wèn)題備受關(guān)注。

圖1 管理不當(dāng)預(yù)計(jì)塑料垃圾增長(zhǎng)情況[4]

為了解決這個(gè)日益嚴(yán)重的問(wèn)題，建立塑料的可持續(xù)利用并循環(huán)再生的模式，塑料的生物解聚和高值化研究無(wú)疑成為綠色新希望。為實(shí)現(xiàn)塑料的回收利用，廢棄塑料都需解聚成單體才能被微生物利用，以塑料的解聚物為原材料獲得高附加值產(chǎn)品，特別是可降解材料，如聚羥基脂肪酸酯(PHA)，是一個(gè)重要的途徑。目前，以歐洲國(guó)家和中國(guó)為首的來(lái)自世界各地的14個(gè)合作伙伴組成的聯(lián)盟“MIX-UP”，致力于使用細(xì)菌進(jìn)行混合塑料的生物降解和回收再利用，研究有效利用混合塑料廢物流的新方法，以解決工業(yè)大規(guī)模長(zhǎng)期使用混合塑料后產(chǎn)生的問(wèn)題。除了重復(fù)使用和回收傳統(tǒng)塑料外，該聯(lián)盟的研究目標(biāo)也包括將塑料混合物升級(jí)為更有價(jià)值的生物材料，以達(dá)到可持續(xù)發(fā)展的目的。

PHA是微生物利用多種碳源發(fā)酵產(chǎn)生的高分子聚酯的總稱(chēng)，在微生物體內(nèi)，PHA 以疏水性顆粒的形式存在，在積累量高的細(xì)菌體內(nèi)，PHA 含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))可以超過(guò)80%；PHA 單體種類(lèi)也比較多元化，如 3-羥基丁酸(3-hydroxybutyrate,3HB)、4-羥基丁酸(4-hydroxybutyrate,4HB)、3-羥基己酸(3-hydroxyhexanoc acid,HHX)和3-羥基戊酸(3-hydroxyvaleric acid,3HV)等[6]。PHA可由生物合成并具有與石油基化學(xué)塑料相似的性質(zhì)，得益于其良好的性能，如生物相容性、疏水性、生物可降解性等，PHA被應(yīng)用于可降解塑料和生物醫(yī)學(xué)材料等方面，被視為聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(PET)和聚丙烯(PP)等傳統(tǒng)石油基化學(xué)塑料的優(yōu)質(zhì)替代品，也被認(rèn)為是解決“白色污染”的一種“綠色塑料”[6]，但PHA生產(chǎn)的高成本和不穩(wěn)定性阻礙了其商業(yè)化進(jìn)程。在PHA工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)化中，目前的研究思路是如何利用廢棄塑料解聚后的產(chǎn)物再來(lái)加工生產(chǎn)PHA，以達(dá)到低成本綠色制造PHA，該研究思路已經(jīng)成為生物材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[7-8]。

近年來(lái)，針對(duì)塑料對(duì)環(huán)境的污染問(wèn)題以及如何高值化再利用廢棄塑料[9]的研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展。基于合成生物學(xué)技術(shù)，在不產(chǎn)生污染的條件下，構(gòu)建具有生物解聚功能的微生物底盤(pán)菌或酶模塊，進(jìn)一步設(shè)計(jì)底盤(pán)菌的代謝途徑，以塑料的解聚物為底物生產(chǎn)高值化合物PHA，是解決PHA生產(chǎn)成本高及市場(chǎng)化問(wèn)題的途徑之一。生物制造PHA在塑料再利用的研究中可歸納為 “生物降解→高值化生物轉(zhuǎn)化→全局微生物代謝流”，為塑料的再利用提供有效的方法，尤其對(duì)于PHA和其他重要材料提供綠色環(huán)保的再生思路。

本文綜述了塑料解聚進(jìn)展、塑料單體的再利用特別是PHA相關(guān)的再利用方面的研究進(jìn)展和不同塑料單體前體底物向不同PHA單體生成的路線(xiàn)設(shè)計(jì)，以期獲得PHA和其他高附加值產(chǎn)品，打造高效的微生物“降塑再造”技術(shù)平臺(tái)。

1 塑料解聚與對(duì)應(yīng)的塑料單體

目前主要以高分子量的合成樹(shù)脂以及石油資源為原料通過(guò)化學(xué)合成得到各種塑料，包括PET、聚苯乙烯(PS)、聚乙烯(PE)和聚氯乙烯(PVC)等。由于塑料的穩(wěn)定性和高分子量等特性，石油基塑料在自然環(huán)境中很難被直接降解，然而，用焚燒法處理塑料不僅會(huì)形成更嚴(yán)重的有毒空氣污染物，而且還產(chǎn)生大量的碳排放。因此，對(duì)廢棄塑料進(jìn)行回收和再利用可以為全球塑料問(wèn)題提供可持續(xù)的解決方案，也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[10]。

目前，塑料處理的方法包括物理法、化學(xué)法和生物法。物理法通常包括廢棄塑料經(jīng)造粒和改性后作為塑料的新料被二次利用，主要包括一、二級(jí)回收。一級(jí)回收是對(duì)未受污染和損壞的塑料進(jìn)行回收，便于再次使用，雖然回收成本偏低，但是重復(fù)使用的持久性和實(shí)用性不是很理想[8]。二級(jí)回收是將廢棄塑料作為回收原料，通過(guò)分離、清洗和研磨等工序后與其他材料共同加工，產(chǎn)品大多用在包裝和建筑等領(lǐng)域。二級(jí)回收受產(chǎn)品使用的多樣性以及原料混合的不均一性限制，這給二次利用帶了困難[10]。如使用廢棄材料低密度聚乙烯(PE-LD)與松木廢料(PWW)制備復(fù)合材料，該種復(fù)合材料隨著PWW 占比的提高，在加工溫度范圍內(nèi)的熱穩(wěn)定性也會(huì)隨之增加[11]，因此通過(guò)實(shí)際應(yīng)用情況調(diào)節(jié) PWW 的含量，同樣是低成本的廢棄塑料作為工業(yè)加工原料的選擇之一。

目前，應(yīng)用較多的化學(xué)法是熱解法、化學(xué)溶解法等，主要包括三、四級(jí)回收。熱解法是指在催化劑作用下，塑料高溫裂解，長(zhǎng)分子鏈分解成更小的產(chǎn)物(如塑料油)，以此作為生產(chǎn)其他塑料的原料，實(shí)現(xiàn)“石油—新塑料—廢塑料—塑料油—新塑料” 的塑料循環(huán)經(jīng)濟(jì)閉環(huán)式產(chǎn)業(yè)鏈，但是熱解法不但需要廣泛優(yōu)化的原材料，而且整個(gè)過(guò)程需要加熱，所以總體來(lái)說(shuō)它是一種耗能和環(huán)境不友好的方法[12-13]?；瘜W(xué)溶解法主要包括醇解法、氨解法和水解法[14]，主要是利用塑料大分子酯鍵的不穩(wěn)定性將塑料溶解，根據(jù)不同化學(xué)試劑反應(yīng)降解的方式，可以分為甲醇、乙醇醇解法，甲胺、乙胺和丁胺氨解法以及濃H2SO4水解法。例如，PET在不同pH下發(fā)生水解，最常用的是濃H2SO4水解法，即在90 ℃、最低H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，可實(shí)現(xiàn)PET完全降解[15]。雖然該法條件溫和，但若要循環(huán)使用高濃度H2SO4以及從H2SO4中分離和凈化塑料單體，成本非常高[15]。同時(shí)，化學(xué)降解法易產(chǎn)生有毒氣體和固體廢棄物，也不是環(huán)境友好的降解方法。

生物降解法是指利用微生物將塑料廢棄物分解轉(zhuǎn)化成小分子物質(zhì)，包括需氧微生物和厭氧微生物兩類(lèi)降解方式。在有氧條件下，需氧微生物將塑料大分子轉(zhuǎn)化為H2O、CO2、礦物質(zhì)和一些有機(jī)體。在無(wú)氧條件下，厭氧微生物將其轉(zhuǎn)化為CO2、腐殖質(zhì)和甲烷。生物降解最大的優(yōu)勢(shì)是不會(huì)留下潛在有害物質(zhì)[16-17]，是最有前景的方法。

目前，廢棄塑料通過(guò)物理、化學(xué)和生物法降解獲得相應(yīng)的單體小分子，常用塑料及其主要降解成分見(jiàn)表1。由此可見(jiàn)，塑料單體的種類(lèi)頗多，大多可以被微生物發(fā)酵再利用，生產(chǎn)PHA等高分子可降解材料以及其他高價(jià)值產(chǎn)品。同時(shí)，如果利用微生物法來(lái)降解塑料，塑料單體又被微生物再利用，不但對(duì)環(huán)境相當(dāng)友好，而且有利于廢棄資源的再生利用，所以這成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。

表1 常用塑料及主要的降解成分

2 塑料單體的再利用

通過(guò)定向挖掘可利用塑料降解物單體的微生物，解析其利用途徑，結(jié)合合成生物學(xué)、代謝工程改造手段，優(yōu)化或設(shè)計(jì)新的代謝路徑，可以獲得能夠利用塑料降解物單體參與中心碳代謝的菌株或者合成新的高值化學(xué)品的菌株。

塑料降解物成分多樣，主要可分為有機(jī)酸、有機(jī)醇、芳香類(lèi)化合物和脂肪烴類(lèi)化合物，微生物利用它們?yōu)榈孜锏拇x途徑已經(jīng)被解析[4]。特別是利用塑料降解物單體重新合成生物可降解塑料PHA，這不僅能夠廢物利用，降低PHA的生產(chǎn)成本，而且還有可能引入特有的官能團(tuán)，改善PHA性能。

目前，在自然條件下，細(xì)菌合成PHA單體的途徑已發(fā)現(xiàn)14種[30]，其中最常見(jiàn)也是在代謝工程改造中最為成熟的是與短鏈PHA合成相關(guān)的乙酰CoA和琥珀酰CoA生成聚羥基丁酸酯(PHB)途徑以及與中長(zhǎng)鏈PHAMCL/LCL-PHA合成相關(guān)的β-氧化途徑和脂肪酸從頭合成途徑(圖2)[31-32]。

圖2 PHA的主要生物合成途徑[30-31]

2.1 有機(jī)酸類(lèi)

己二酸(adipic acid，AA)是一種重要的工業(yè)原料，也是PU等塑料的降解物之一，其降解途徑首先在不動(dòng)桿菌Acinetobacterbaylyi中被發(fā)現(xiàn)[32]。己二酸首先在琥珀酰CoA轉(zhuǎn)移酶的催化下形成己二酰CoA，再脫氫生成2，3-脫氫己二酰CoA，接著在水合酶催化下生成3-羥基己二酰CoA，然后脫氫生成3-酮基己二酰CoA，最后在?；鵆oA硫解酶催化下生成琥珀酰CoA和乙酰CoA，它們可以進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)參與細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝，也可以作為PHA單體的前體物質(zhì)，經(jīng)β-酮基硫解酶(PhaA)和乙酰乙酰輔酶A還原酶(PhaB)催化生成羥丁酰輔酶A，再由PHA聚合酶(PhaC)催化得到PHA聚合物。近期，Ackermann等[33]通過(guò)定向進(jìn)化和基因組整合dcaAKIJP基因簇的方法獲得了1株能夠高效利用己二酸生長(zhǎng)的惡臭假單胞菌P.putidaKT2440，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在限氮條件下該菌株能夠利用己二酸合成PHA，最終PHA含量達(dá)到細(xì)菌干質(zhì)量的25%。

2.2 有機(jī)醇類(lèi)

2.2.1 乙二醇

乙二醇是PET、PU等塑料的降解物之一。在惡臭假單胞菌P.putidaKT2440中，乙二醇首先在醇脫氫酶的催化下轉(zhuǎn)化為乙醇醛，然后被醛脫氫酶還原為乙醇酸，接著在乙醇酸氧化酶(GlcDEF)的作用下生成乙醛酸[34]，生成的乙醛酸可以在異檸檬酸裂解酶的催化下與丁二酸縮合形成異檸檬酸進(jìn)入TCA循環(huán)，也可以通過(guò)蘋(píng)果酸合成酶與乙酰CoA形成蘋(píng)果酸進(jìn)入TCA循環(huán)。此外，在P.putidaJM37中存在的乙醛酸羧化酶(Gcl)，可催化乙醛酸生成酒石酸半醛，然后在羥基丙酮酸異構(gòu)酶和酒石酸酯半醛還原酶(GlxR)的作用下生成甘油酸，最后磷酸化后進(jìn)入糖酵解途徑，可生成乙酰CoA[23]。Franden等[23]在P.putidaKT2440中過(guò)表達(dá)gcl、glxR和glcDEF后發(fā)現(xiàn)，這顯著增強(qiáng)了菌株對(duì)乙二醇的耐受力(2 mol/L)和利用能力(0.5 mol/L)，而且改造后的菌株能夠利用乙二醇合成MCL-PHA，PHA含量可達(dá)32%。

2.2.2 1，4-丁二醇(1,4-BDO)

1，4-丁二醇是PU、PBT和PBAT等塑料的降解物之一。雖然野生型P.putidaKT2440能夠以1,4-BDO為唯一碳源生長(zhǎng)，但速度非常緩慢。Li等[35]通過(guò)定向進(jìn)化分離出生長(zhǎng)速度顯著提高的突變菌株，并進(jìn)行基因組學(xué)測(cè)序和蛋白組學(xué)分析，解析了1,4-BDO降解的基因組和代謝途徑。首先，1,4-BDO被氧化為4-羥基丁酸，這一步主要由PP_2674-2680基因簇內(nèi)編碼的高表達(dá)的脫氫酶催化生成，4-羥基丁酸鹽可以通過(guò)3種可能的途徑進(jìn)行代謝：①氧化為琥珀酸；②CoA活化并隨后氧化為琥珀酰CoA；③經(jīng)β-氧化轉(zhuǎn)化為乙醇酰CoA和乙酰CoA。4-羥基丁酸CoA、乙酰CoA和琥珀酰CoA均是PHA合成的單體或前體物質(zhì)，在限氮條件下，P.putidaKT2440能夠積累PHA，如果在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)加辛酸，PHA含量最高可達(dá)到64%[26]。

2.3 芳香類(lèi)塑料降解物

2.3.1 對(duì)苯二甲酸(terepththalic acid,TPA)

TPA是PET的主要降解物。叢毛單胞菌Comamonastestosteroni可以TPA為唯一碳源生長(zhǎng)，TPA的降解途徑首先在此菌株中被詳細(xì)解析[26]。TPA在微生物胞內(nèi)首先經(jīng)1，2-雙加氧酶和脫氫酶兩步作用生成中間產(chǎn)物原兒茶酸，原兒茶酸的進(jìn)一步降解則具有物種特異性[36]，因?yàn)椴煌慕到馔緩綍?huì)直接影響碳的利用率。如果通過(guò)鄰位裂解或者兒茶酚降解生成琥珀酰CoA、乙酰CoA和2分子CO2，這樣8個(gè)碳原子只保留6個(gè)；如果通過(guò)間位裂解得到丙酮酸和草酰乙酸，可保留7個(gè)碳原子。Kenny等[37]利用熱降解PET產(chǎn)生的TPA作為唯一碳源，培養(yǎng)惡臭單胞菌P.putidaGO16，以此開(kāi)發(fā)了一種從TPA和甘油的混合物生產(chǎn)MCL-PHA的發(fā)酵工藝。Tiso等[38]研究發(fā)現(xiàn)，用工程化菌株P(guān).putidaGO16可利用PET酶解產(chǎn)物——TPA和乙二醇，生產(chǎn)PHA和鼠李糖脂。

2.3.2 苯酚

苯酚是聚碳酸酯(例如PA)塑料的降解物之一。由于苯酚是煤炭和汽油中的主要污染物，也可用作防腐劑，所以很早就對(duì)苯酚的生物降解進(jìn)行了研究。苯酚的降解始于苯酚羥化酶在鄰位的單羥基化，生成兒茶酚，后續(xù)降解途徑與TPA相似，通過(guò)鄰位裂解或間位裂解產(chǎn)生琥珀酰CoA和乙酰CoA，或產(chǎn)生丙酮酸和草酰乙酸。在厭氧條件下，通過(guò)羧化作用生成4-羥基苯甲酸酯，CoA激活后通過(guò)β-氧化作用進(jìn)一步降解。目前，利用苯酚作為唯一或主要碳源來(lái)生產(chǎn)高值化學(xué)品的研究較少，Zhang等[39]研究了以毒性工業(yè)廢棄物苯酚作為碳源生產(chǎn)PHA的可行性，并考察碳氮比、pH、溶氧、溫度、離子濃度及苯酚濃度等對(duì)微生物利用苯酚積累PHA的影響。Kanavaki等[40]研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌Pseudomonassp.phDV1可以苯酚為唯一碳源生長(zhǎng)，并能夠積累PHB。

2.4 脂肪烴類(lèi)

2.4.1 脂肪烴

對(duì)PE和PP等塑料降解處理時(shí)會(huì)獲得不同長(zhǎng)度的脂肪烴。在微生物中，脂肪烴首先會(huì)被單加氧酶氧化為伯醇，然后進(jìn)一步被氧化為對(duì)應(yīng)的醛和脂肪酸，而脂肪酸經(jīng)?；鵆oA合成酶活化后進(jìn)入β-氧化最終被降解為乙酰CoA。能利用脂肪烴合成PHA的菌株有食油假單胞菌P.oleovorans[41]、富養(yǎng)羅爾斯通氏菌Cupriavidusnecator[42]和綠膿假單胞菌P.aeruginos[22]等菌株。除了以乙酰CoA的形式參與PHA合成外，近期Li等[43]研究發(fā)現(xiàn)，在假單胞菌P.entomophila中，通過(guò)弱化β-氧化途徑，在中長(zhǎng)碳鏈的脂肪酸中9～18位的碳可被催化生成MCL/LCL-PHA單體，同時(shí)以葡萄糖為碳源獲得短鏈單體3HB，經(jīng)過(guò)篩選PhaC，可實(shí)現(xiàn)短鏈與中長(zhǎng)鏈PHA共聚，最終獲得具有特殊熱性能和力學(xué)性能的PHA。

2.4.2 苯乙烯

苯乙烯是PS塑料的單體。微生物中的苯乙烯降解途徑主要有3條[44]：①側(cè)鏈乙烯基的氧化途徑是苯乙烯的主要降解途徑，在苯乙烯單氧酶的催化下轉(zhuǎn)化為氧化苯乙烯，然后通過(guò)側(cè)鏈氧化轉(zhuǎn)化為苯乙酸，環(huán)活化，再經(jīng)β-氧化生成乙酰CoA進(jìn)入TCA循環(huán)或轉(zhuǎn)化為PHA；②苯乙烯在苯乙烯雙加氧酶作用下生成苯乙烯順式乙二醇，再被氧化為3-乙烯基鄰苯二酚，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為丙酮酸進(jìn)入中心代謝；③在戈登氏菌GordoniarubripertinctaCWB2中，苯乙烯經(jīng)單氧酶激活側(cè)鏈后，通過(guò)谷胱甘肽轉(zhuǎn)化為苯乙酸，最終被降解為2分子乙酰CoA和琥珀酰CoA[45]。惡臭假單胞菌P.putida[20]、腸桿菌Enterobacterspp.[46]等菌株均能夠利用苯乙烯合成PHA。表2總結(jié)了塑料降解物用于PHA生物合成的研究情況。

表2 用于PHA生物合成的塑料降解物

3 塑料單體向不同PHA單體的生成路線(xiàn)設(shè)計(jì)

生產(chǎn)成本是PHA大范圍應(yīng)用的重要限制因素，雖然塑料單體作為底物合成PHA可實(shí)現(xiàn)資源的循環(huán)再利用，但是如何提高不同塑料單體到PHA的轉(zhuǎn)化率依然是實(shí)現(xiàn)塑料單體最大化利用、降低PHA成本的關(guān)鍵問(wèn)題。不同塑料單體到不同PHA單體的固有理論轉(zhuǎn)化率不同，在塑料單體被再利用時(shí)，可優(yōu)先選擇生產(chǎn)理論轉(zhuǎn)化率比較高的PHA單體，這有利于指導(dǎo)提高實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中的轉(zhuǎn)化率，實(shí)現(xiàn)塑料單體的最大化利用，也有利于實(shí)現(xiàn)真正意義上的綠色低碳循環(huán)經(jīng)濟(jì)。同樣，Tiso等[48]在2022年綜述了塑料降解為單體的途徑，并計(jì)算了它們對(duì)工業(yè)上較常見(jiàn)產(chǎn)品的理論產(chǎn)量，由此提出，塑料的單體是化石基產(chǎn)品的碳源替代物，碳的轉(zhuǎn)化率而非產(chǎn)品的產(chǎn)量是決定生化循環(huán)升級(jí)再利用的關(guān)鍵因素?？梢?jiàn)，塑料單體發(fā)酵的意義重大，在發(fā)酵過(guò)程中，轉(zhuǎn)化率又是碳循環(huán)的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)?；诖耍覀兛偨Y(jié)了文獻(xiàn)研究的不同種類(lèi)塑料單體到不同種類(lèi)PHA的代謝路徑(圖3)、具體的反應(yīng)過(guò)程(表3)及相應(yīng)的理論轉(zhuǎn)化率等參考指標(biāo)(表4)，并應(yīng)用相關(guān)的理論分析后以建立相關(guān)的塑料單體的利用策略。我們著重選取了6種來(lái)自不同類(lèi)型且具有一定代表性的廢棄塑料單體進(jìn)行分析。

表3 塑料降解物用于PHA生物合成的反應(yīng)式

圖3 塑料單體合成不同PHA的代謝途徑

己二酸的代謝產(chǎn)物為琥珀酰CoA和乙酰CoA，琥珀酰CoA可作為聚四羥基丁酸酯(P4HB)和聚三羥基戊酸酯(P3HV)合成的前體，而乙酰CoA可作為聚三羥基丁酸酯(PHB)、聚三羥基丙酸酯(P3HP)和P3HV合成的前體(圖3)。此外，乙酰CoA可通過(guò)脂肪酸從頭合成途徑和反向β-氧化循環(huán)合成中長(zhǎng)鏈的PHA。之前的研究已被證明己二酸可被A.baylyi作為唯一碳源利用[32]，通過(guò)在P.putida中過(guò)表達(dá)己二酸代謝通路中的相關(guān)基因，可使其利用己二酸作為唯一碳源產(chǎn)PHA[33]。從表4的轉(zhuǎn)化率結(jié)果來(lái)看，己二酸到PHA前體的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)66%，但是在假單胞菌中，實(shí)際的轉(zhuǎn)化率只有9.2%左右[33]。從表4的熱力學(xué)變化可知，在己二酸利用的過(guò)程中，只有生成P3HP和P3HA這樣的中長(zhǎng)鏈PHA在熱力學(xué)上是有利的，但是從己二酸到P3HP和P3HA的過(guò)程較長(zhǎng)，在實(shí)際的代謝改造中難以調(diào)節(jié)相應(yīng)的代謝通量。所以在利用己二酸生產(chǎn)PHA的過(guò)程中，為使過(guò)程更綠色高效，應(yīng)綜合考慮生產(chǎn)過(guò)程中碳轉(zhuǎn)化率的高低，熱力學(xué)上是否有利以及過(guò)程是否過(guò)長(zhǎng)而難以調(diào)節(jié)，以碳轉(zhuǎn)化率、吉布斯自由能變化和反應(yīng)步驟數(shù)為參考指標(biāo)，分別將3個(gè)參考指標(biāo)按優(yōu)劣程度從高到低分為5分、4分、3分、2分和1分，在生產(chǎn)PHA過(guò)程中將3個(gè)參考指標(biāo)的得分進(jìn)行累加，以總分進(jìn)行評(píng)價(jià)比較(表4)后發(fā)現(xiàn)，用己二酸生產(chǎn)P4HB較優(yōu)。

表4 塑料單體合成不同PHA的比較分析

乙二醇在微生物胞內(nèi)的主要利用過(guò)程是被降解為乙醛酸后再進(jìn)入TCA循環(huán)和PHA生成過(guò)程[48]，在之前的研究中，大多以假單胞菌作為底盤(pán)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)乙二醇的循環(huán)再利用。目前關(guān)于乙二醇作為唯一碳源到特定PHA的碳轉(zhuǎn)化率大約只有3.1%[33]，離理論最大轉(zhuǎn)化率還有較大差距。通過(guò)對(duì)乙二醇生產(chǎn)各種PHA過(guò)程的碳轉(zhuǎn)化率、熱力學(xué)變化和反應(yīng)過(guò)程長(zhǎng)短進(jìn)行綜合分析后可以推斷，乙二醇可能更適合用來(lái)生產(chǎn)中長(zhǎng)鏈PHA。

通過(guò)metacyc等代謝數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)到1，4-丁二醇的降解中間產(chǎn)物巴豆酰CoA(crotonyl-CoA)除可直接流向4-羥基丁酰CoA外，也可通過(guò)惡庚英CoA 水解酶(PaaZ)直接流向PHB的前體。目前1，4-丁二醇作碳源，通過(guò)外源添加辛酸，PHA的得率可超過(guò)60%，但是碳轉(zhuǎn)化率不到9%[33]，然而理論上，1，4-丁二醇最高可實(shí)現(xiàn)151%的P3HP的碳轉(zhuǎn)化率。綜上可知，1，4-丁二醇用來(lái)生產(chǎn)P3HP或者中長(zhǎng)鏈P3HA可能更優(yōu)。

對(duì)苯二甲酸與己二酸降解過(guò)程類(lèi)似，可通過(guò)代謝中間產(chǎn)物3-氧代己二酰CoA轉(zhuǎn)化為乙酰CoA和琥珀酰CoA，再經(jīng)過(guò)各種PHA合成通路相關(guān)酶的參與，來(lái)生產(chǎn)各類(lèi)短中長(zhǎng)鏈PHA。通過(guò)添加甘油作為共底物培養(yǎng)，P.putidaGO16的PHA生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到108.8 mg/(L·h)[37]，由于是混合底物，所以碳轉(zhuǎn)化率難以計(jì)算。而對(duì)苯二甲酸到P4HB的理論最大轉(zhuǎn)化率為52%，同時(shí)綜合得分情況分析后推斷，對(duì)苯二甲酸更適合用于生產(chǎn)P4HB。

苯酚可通過(guò)開(kāi)環(huán)氧化成3-氧代己二酸進(jìn)入與對(duì)苯二甲酸類(lèi)似的降解過(guò)程，Zhang等[39]通過(guò)調(diào)節(jié)混合培養(yǎng)體系中的碳氮比、溶氧量和pH等條件可實(shí)現(xiàn)以苯酚作為碳源生產(chǎn)PHA，產(chǎn)率超過(guò)65%，但是由于苯酚的強(qiáng)烈生長(zhǎng)抑制性，最后的細(xì)胞生物量也僅2 g/L左右?？梢?jiàn)，在有限的生長(zhǎng)條件下，如何最大化利用苯酚則是最應(yīng)該關(guān)注的問(wèn)題，同時(shí)從綜合得分情況來(lái)看，苯酚作為碳源來(lái)生產(chǎn)P3HP對(duì)于提升苯酚的循環(huán)利用可能更有利。

脂肪烴可從聚乙烯降解過(guò)程產(chǎn)生，以十六烷或棕櫚酸為代表，棕櫚酸是自然界分布最廣泛、含量最豐富的多不飽和脂肪酸[49]，十六烷經(jīng)過(guò)單加氧酶等催化轉(zhuǎn)化成棕櫚酸，然后進(jìn)入β-氧化，最終被降解為乙酰CoA，每一次β-氧化循環(huán)會(huì)產(chǎn)生1分子乙酰CoA，需要8次循環(huán)，十六烷即可完全降解為乙酰CoA，再以乙酰CoA為前體合成各類(lèi)短鏈PHA，但是在合成中長(zhǎng)鏈的P3HA時(shí)，需要敲除β-氧化的后半循環(huán)部分(圖3)[43]?？梢?jiàn)，十六烷更適合用來(lái)生產(chǎn)P4HB和長(zhǎng)鏈的P3HB。

綜上可知，對(duì)6種廢棄塑料單體(己二酸、乙二醇、1，4-丁二醇、對(duì)苯二甲酸、苯酚和十六烷)為原料生產(chǎn)5種利用率較高的PHA(包括PHB、P4HB、P3HV、P3HP、P3HA)的利用策略進(jìn)行評(píng)價(jià)，以綜合得分為指標(biāo)可知：用己二酸生產(chǎn)P4HB較優(yōu)；乙二醇更適合用來(lái)生產(chǎn)中長(zhǎng)鏈PHA，如P3HP和P3HA；1，4-丁二醇用來(lái)生產(chǎn)P3HP或者中長(zhǎng)鏈P3HA更優(yōu)；對(duì)苯二甲酸與己二酸降解過(guò)程類(lèi)似，對(duì)苯二甲酸生產(chǎn)P4HB更優(yōu)、苯酚用于生產(chǎn)P3HP更佳；十六烷更適合生產(chǎn)P4HB和長(zhǎng)鏈的P3HA。

4 結(jié)論與展望

隨著塑料生產(chǎn)量和堆積量的不斷增加，廢棄塑料的回收與再利用成為發(fā)展塑料循環(huán)經(jīng)濟(jì)的關(guān)鍵。PHA由于其良好的生物可降解性、生物相容性以及種類(lèi)和性能的多樣性等特點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注，然而生產(chǎn)成本和熱力學(xué)性能依然是制約PHA生物塑料大規(guī)模生產(chǎn)的最大難題。塑料降解物主要的單體己二酸、乙二醇、1，4-丁二醇、對(duì)苯二甲酸、苯酚、苯乙烯和脂肪烴等都可被用于微生物的PHA合成，并通過(guò)設(shè)計(jì)和優(yōu)化相關(guān)的代謝通路，有效篩選高效的通路和相關(guān)的酶以及全局代謝流調(diào)控，增強(qiáng)微生物對(duì)塑料單體的利用能力，提高PHA的產(chǎn)量。這些成果充分證明了基于合成生物學(xué)的微生物資源篩選、關(guān)鍵酶元件的挖掘，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)塑料單體的高值化利用將是推動(dòng)廢棄塑料資源循環(huán)利用的有效途徑。

1)廢棄塑料通常大量摻雜混合物，針對(duì)特定的塑料分離回收、降解，耗時(shí)耗力，成本花費(fèi)較高或仍存在環(huán)境污染問(wèn)題。廢棄塑料的物理降解方法存在的常見(jiàn)問(wèn)題有：塑料制品重復(fù)使用后，持久性和實(shí)用性降低；在二次利用過(guò)程中，混合產(chǎn)物的不均一性會(huì)引起塑料制品的多樣化。熱解法則存在不同塑料熱解溫度和壓強(qiáng)差異較大、耗能大的問(wèn)題；催化劑的毒副作用和釋放有毒氣體等引起環(huán)境不友好的問(wèn)題。

2)生物酶解法的優(yōu)勢(shì)是通過(guò)酶催化作用讓物質(zhì)自身分解。由于生物酶解催化的機(jī)制不確定性、菌種和相應(yīng)酶的限制，所以最終的催化效率較低，因此，繼續(xù)深入了解生物酶解技術(shù)的作用機(jī)制、篩選高效的酶和提高酶解速率具有重要的意義。同時(shí)，以降解物來(lái)高值化生產(chǎn)可降解材料PHA，可以達(dá)到綠色生物制造目的，綜合循環(huán)利用廢棄資源，變廢為寶。然而，廢棄塑料解聚后的單體種類(lèi)較多，生物利用率參差不齊。特別是單體的利用，在面臨著可用的菌種少和酶源有限等問(wèn)題的同時(shí)，更存在實(shí)際生產(chǎn)中酶活效率低、菌種對(duì)于不同廢棄塑料單體的耐受性差異較大、底物利用率及轉(zhuǎn)化率偏低等一系列問(wèn)題，這是以后研究的重點(diǎn)，也亟待突破瓶頸。

3)提高不同塑料單體向PHA的轉(zhuǎn)化率是提高PHA產(chǎn)量和降低成本的關(guān)鍵。比如，在篩選高效酶的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高酶活性、選擇耐受性良好的菌株以及綜合評(píng)估代謝通路的能量消耗、反應(yīng)偏好性和反應(yīng)步驟等因素，來(lái)進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化率。定向進(jìn)化，如用輻射(紫外線(xiàn)和可見(jiàn)光譜)和常壓室溫等離子體(ARTP)誘變處理是目前篩選酶和菌株的高效方法。同時(shí)，基于分析發(fā)現(xiàn)不同塑料單體到不同PHA單體的固有理論轉(zhuǎn)化率不同，通過(guò)參照不同種類(lèi)塑料單體到不同種類(lèi)PHA的代謝路徑、相應(yīng)的理論轉(zhuǎn)化率、吉布斯自由能變化和相應(yīng)的反應(yīng)步驟等參考指標(biāo)，分析比較塑料單體的代謝策略，以期獲得最適單體和相應(yīng)菌株高產(chǎn)PHA的利用途徑和方法。

4)總結(jié)塑料單體向PHA轉(zhuǎn)化的利用途徑，并調(diào)節(jié)其與底盤(pán)菌之間的適配情況，甚至開(kāi)發(fā)幾種菌體混合發(fā)酵的應(yīng)用工藝。以底物轉(zhuǎn)化率、能量和反應(yīng)步驟為指標(biāo)，總結(jié)不同種類(lèi)塑料單體到不同種類(lèi)PHA轉(zhuǎn)化偏好性以指導(dǎo)實(shí)際的PHA生產(chǎn)。同樣也可以利用生物信息學(xué)技術(shù)分析不同菌種酶和底物的適配性，通過(guò)定向進(jìn)化、高通量篩選來(lái)改造酶反應(yīng)的效率。進(jìn)一步，可以考慮混合底物的混合培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)高值化產(chǎn)品，達(dá)到資源綜合利用的目的。從節(jié)約酶的成本考慮，有機(jī)醇都需要脫氫，苯環(huán)類(lèi)物質(zhì)都需要氧化開(kāi)環(huán)，這可通過(guò)高通量的手段篩選廣譜性的酶，統(tǒng)一的代謝路徑催化有機(jī)醇和苯環(huán)類(lèi)物質(zhì)，詳細(xì)分析中間產(chǎn)物是否可以重疊使用，這樣盡量減少代謝反應(yīng)步驟，節(jié)約酶成本，實(shí)現(xiàn)酶的高效利用和高效生產(chǎn)。

綜合圍繞“生物降解→高值化生物轉(zhuǎn)化→全局微生物代謝流” 這一路線(xiàn)，對(duì)現(xiàn)有研究進(jìn)行總結(jié)，可以發(fā)現(xiàn)，雖然在廢棄塑料的降解、PHA的轉(zhuǎn)化率、代謝調(diào)控方面(如高效酶、廣譜酶的篩選和一酶多用等)存在諸多問(wèn)題，但是利用廢棄塑料的降解產(chǎn)物生產(chǎn)PHA，進(jìn)一步提高PHA的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力和應(yīng)用前景，可為綠色環(huán)保的塑料循環(huán)經(jīng)濟(jì)提供有效平臺(tái)和方法。