孟令雪，郭旭，孫新迪，沈洋，張偉偉，2，楊清竹，2，邵淑麗，2

（齊齊哈爾大學(xué) 1.生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

肺癌是最常見(jiàn)的癌癥類型之一.2020 年，全球約有1 930 萬(wàn)例新癌癥病例，1 000 萬(wàn)例癌癥死亡病例.肺癌的新發(fā)病例排第二位（11.4%），約有180 萬(wàn)人因肺癌死亡（18%），其是癌癥死亡的主要因素[1].在肺癌治療中，化學(xué)療法被認(rèn)為是所有階段的重要治療手段[2]，但不可避免癌細(xì)胞出現(xiàn)耐藥性，進(jìn)而導(dǎo)致化療失敗.多藥耐藥（MDR）常見(jiàn)的機(jī)制是癌細(xì)胞中ATP 結(jié)合盒（ABC）外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過(guò)表達(dá).多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的ABCC 亞家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也被稱為ABCC1[3]，它是一個(gè)在人體組織中廣泛表達(dá)的谷胱甘肽轉(zhuǎn)運(yùn)泵，通過(guò)將GSH 和化療藥物一同泵出細(xì)胞外發(fā)揮了保護(hù)細(xì)胞的作用[4-5].已有研究證實(shí)，MRP1的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肺癌[6]、上皮性卵巢癌[7]、乳腺癌[8]、原發(fā)性神經(jīng)母細(xì)胞瘤[9]等腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)而影響患者的化療效果.因此，干擾MRP1的表達(dá)是逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞耐藥性的關(guān)鍵環(huán)節(jié).

成簇的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）-Cas（CRISPR 相關(guān)蛋白）是一種原核適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，只存在于細(xì)菌及古生菌中，在真核生物及病毒中未發(fā)現(xiàn).目前使用最廣泛的是可用于編輯人類基因組的釀膿鏈球菌Ⅱ型CRISPR/Cas9[10].CRISPRi 工具采用滅活的Cas9（dCas9），其上的2 個(gè)核酸酶域發(fā)生突變，會(huì)與DNA 結(jié)合，但不具有DNA 切割活性.因此，該方法可以抑制基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致基因沉默[11].目前，應(yīng)用CRISPRi 技術(shù)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的研究已經(jīng)逐漸深入[12].

本研究利用CRISPRi 技術(shù)構(gòu)建MRP1干擾表達(dá)載體，沉默A549/DDP 細(xì)胞內(nèi)MRP1基因的表達(dá)，檢測(cè)其對(duì)川楝素敏感性的變化，為肺癌耐藥性逆轉(zhuǎn)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺癌A549 細(xì)胞株，人肺癌順鉑耐藥株A549/DDP 細(xì)胞（北京腫瘤生物中心）；川楝素（南通飛宇生物科技有限公司）；RPMI-1640 培養(yǎng)基干粉（Gibico 公司）；胎牛血清（以色列Biological Iudustries）；質(zhì)粒pSPgRNA（Genscript 公司（Scotch Plams USA），由實(shí)驗(yàn)室前期保存）；E.coliDH5α，質(zhì)粒快速小量提取試劑盒，UNIQ-10 柱式總RNA 提取試劑盒，M-MuLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒，全蛋白提取試劑盒，DNA Marker（1Kb），蛋白Marker，吖啶橙，EDTA（上海生工生物工程股份有限公司）；Power SYBR?Green PCR Master Mix 試劑盒（Bioteke Corporation）；MRP1，β-actin一抗，羊二抗（美國(guó)LI-COR 公司）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CRISPRi 技術(shù)構(gòu)建MRP1干擾表達(dá)載體 根據(jù)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)網(wǎng)站（http://zifit.partners.org///www.ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx）對(duì)MRP1基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)軟件（http:genomatix.de/en/index.html）預(yù)測(cè)的MRP1啟動(dòng)子上節(jié)能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子確定3 個(gè)CRISPRi 干擾位點(diǎn)（見(jiàn)表1），每個(gè)片段的5′加BbsⅠ酶切位點(diǎn)序列送sangon 合成.

表1 靶向MRP1 啟動(dòng)子的3 個(gè)CRISPRi 干擾位點(diǎn)

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃，5% CO2與飽和濕度環(huán)境下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺癌A549 和A549/DDP 細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行傳代及后續(xù)處理，并收集細(xì)胞樣品用于實(shí)驗(yàn).

1.2.3 qRT-PCR 檢測(cè)MRP1mRNA 的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，使用Trizol 法提取總RNA，用TOYOBO 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板，用TAKARA 熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系為：5 μL 染料、2.5 μL 水、上下游引物共1 μL，cDNA 1.5 μL.選用GAPDH為內(nèi)參，上游引物序列為：5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，下游引物序列為：5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′.MRP1上游引物序列為：5′-GGGGTCCTCATTATCTTCTGG-3′，下游引物序列為：5′-TGGTCTCAGGGTAGGGGTTAG-3′.所得結(jié)果以2-△△Ct方法計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)量.

1.2.4 Western blot 檢測(cè)MRP1 蛋白表達(dá) 將細(xì)胞接種到6 孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期，將干擾載體轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中培養(yǎng)48 h，RIPA 裂解液提取總蛋白，SDS-PAGE 電泳后將蛋白樣電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶封閉1.5 h，MRP1 一抗（均按1∶500 進(jìn)行稀釋）4 ℃孵育過(guò)夜，PBST 洗膜3 次，兔二抗（1∶1 000稀釋）室溫避光孵育1 h，PBST 洗膜3 次，用Odyssey IR 成像儀避光掃描蛋白條帶，數(shù)據(jù)使用ImageJ 進(jìn)行分析處理.

1.2.5 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞藥物敏感性 收集A549/DDP、轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)對(duì)照組及sgRNA-MRP1-2 組48 h 后的細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液將收集到的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，按照每孔5×105個(gè)的密度接種到96 孔板中，分別加入濃度為0，20，40，60，80，100 nmol/L 的川楝素作用24 h，在每孔中加入20 μL 5 mg/mL 的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入180 μL DMSO，輕輕晃動(dòng)后，靜置15 min.在單波長(zhǎng)570 nm 處測(cè)定光吸收值，計(jì)算各藥物濃度下的細(xì)胞存活率，確定IC50值.細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值×100%.

1.2.6 激光共聚焦檢測(cè)人肺癌A549/DDP 細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，傳代至裝有蓋玻片的6 孔板中，細(xì)胞數(shù)達(dá)到一定量時(shí)，采用PEI 轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染Scrambled 及sgRNA-MRP1-2 重組載體48 h 后，加入終濃度為60 nmol/L 的川楝素繼續(xù)培養(yǎng)48 h.再用1 mL 預(yù)冷PBS 洗滌細(xì)胞，用1 mL 甲醇固定30 min，滴加200 μL吖啶橙，使吖啶橙覆蓋所有細(xì)胞，用鑷子將玻片取出，倒扣在處理干凈的載玻片上，用藍(lán)色光激發(fā)，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照.

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，用SPSS 25 軟件分析，采用Graphpad Prism 5軟件作圖.使用student t 檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較.

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPRi 技術(shù)構(gòu)建MRP1 干擾載體

根據(jù)MRP1基因啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)合成3 對(duì)CRISPRi 片段，定向克隆到pSPgRNA 載體上，重組載體測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖1.由圖1 可見(jiàn)，重組干擾載體序列與預(yù)期完全一致，3 種靶向MRP1干擾表達(dá)載體構(gòu)建成功.

圖1 MRP1 基因重組質(zhì)粒測(cè)序圖譜

2.2 qRT-PCR 和Western Blot 檢測(cè)干擾載體對(duì)MRP1 基因表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染干擾載體后，細(xì)胞中MRP1基因的表達(dá)見(jiàn)圖2～3.與A549/DDP 細(xì)胞相比，各重組載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中MRP1基因的mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）.其中轉(zhuǎn)染sgRNA-MRP1-2 重組質(zhì)粒的細(xì)胞沉默效果最顯著，MRP1mRNA 和蛋白的表達(dá)水平分別降低了59.3%，42.4%（P<0.05）.

圖2 各組細(xì)胞MRP1 mRNA 和蛋白表達(dá)情況

2.3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對(duì)藥物敏感性變化的影響

順鉑對(duì)各組細(xì)胞的IC50值（見(jiàn)表2）顯示，與A549/DDP 細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染sgRNA-MRP1-2 組的IC50顯著降低（P<0.001），無(wú)關(guān)對(duì)照組與A549/DDP 組無(wú)顯著差異，表明沉默MRP1基因后細(xì)胞對(duì)川楝素的敏感性增強(qiáng).

表2 各組IC50值

2.4 激光共聚焦顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)

激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)（見(jiàn)圖4）.由圖4 可見(jiàn)，未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列組，細(xì)胞均輪廓清晰，且鏡下細(xì)胞數(shù)量較多，未出現(xiàn)明顯凋亡特征.轉(zhuǎn)染sgRNA-MRP1-2 組細(xì)胞部分發(fā)生破碎、邊緣化，視野下細(xì)胞總數(shù)大量減少.

圖4 TSN 處理48 h 后顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)變化

3 結(jié)論與討論

成功構(gòu)建3 種靶向MRP1干擾表達(dá)載體并沉默A549/DDP 細(xì)胞中MRP1的基因表達(dá)，在60 nmol/L 的川楝素作用下，細(xì)胞凋亡程度增加，提高了細(xì)胞對(duì)川楝素的敏感性.

腫瘤的發(fā)生率和死亡率逐年上升，大多數(shù)肺癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期.除了早期手術(shù)之外，化療是腫瘤治療的重要手段，化療效果不理想的主要原因之一是腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥，腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥的產(chǎn)生是一個(gè)非常復(fù)雜且相關(guān)因素較多的過(guò)程.導(dǎo)致肺癌多藥耐藥的因素中，P 糖蛋白（P-gp）和MRP 蛋白家族如MRP1的高表達(dá)是導(dǎo)致肺癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的重要原因之一.這些外排泵蛋白會(huì)將藥物泵出細(xì)胞外，降低了細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，從而使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性.如利用RNAi 技術(shù)沉默MRP1基因，逆轉(zhuǎn)了肝細(xì)胞癌的多藥耐藥[13].因此，調(diào)節(jié)MRP1基因的表達(dá)有可能成為逆轉(zhuǎn)癌癥耐藥并提高化療成功率的有效策略之一[14-15].

CRISPRi 技術(shù)基于一個(gè)無(wú)核酸酶活性的dCas9 蛋白，其失去切割DNA 的活性，但仍保留結(jié)合DNA 的能力.當(dāng)dCas9 被引導(dǎo)到某個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS（transcription start site）時(shí)，dCas9 能夠物理性地阻礙RNA 聚合酶的通過(guò)，由此導(dǎo)致基因沉默，因此相較于RNAi 技術(shù)，CRISPRi 技術(shù)能抑制指定基因的轉(zhuǎn)錄起始，其擁有比RNAi 更高的干擾效率和更低的脫靶風(fēng)險(xiǎn)，在基因干擾能力上要優(yōu)于傳統(tǒng)RNAi 技術(shù).

川楝素是從楝樹(shù)根皮提取到的一種四環(huán)三萜類化合物[16].川楝素抗腫瘤的研究最早是由G R Pettit從楝科植物中提取的化合物對(duì)小鼠P388淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系增殖的抑制作用[17].最近的研究發(fā)現(xiàn)，川楝素具有廣譜抗腫瘤效果，能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，如肺癌A549細(xì)胞、白血病HL-60細(xì)胞和肝癌Hep3B細(xì)胞等[18-20].但其作為一種藥物制劑，在作用的同時(shí)也會(huì)受到細(xì)胞耐藥性的影響.本實(shí)驗(yàn)是在沉默MRP1基因的基礎(chǔ)上，再加入60 nmol/L的川楝素作用于細(xì)胞，檢測(cè)沉默MRP1對(duì)人肺癌A549/DDP細(xì)胞的藥物敏感性和細(xì)胞形態(tài)的影響.結(jié)果與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染后加藥組的藥物敏感性顯著增加，激光共聚焦顯微鏡下觀察到細(xì)胞由梭形變?yōu)闄E圓形等凋亡現(xiàn)象，說(shuō)明干擾MRP1基因的表達(dá)，可逆轉(zhuǎn)人肺癌耐藥株A549/DDP細(xì)胞的耐藥性，有效提升腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性.本研究結(jié)果可為川楝素在腫瘤臨床治療中研發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).