白 雪，張 哲，李晨佳,2，宋 文，李 英，莫曉婷，尚 蕾，李萬水，葉 健

（1.公安部物證鑒定中心，北京 100038；2. 河北醫(yī)科大學(xué)，石家莊 050017； 3. 公安部第一研究所，北京 100044）

基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的遺傳分析儀及STR復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)試劑是法醫(yī)物證檢驗(yàn)的重要手段，個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定多賴之實(shí)現(xiàn)。目前，國(guó)內(nèi)外公司主流產(chǎn)品為5～6色熒光STR復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)試劑，其應(yīng)用 6FAM-VIC-NED-PET-LIZ、6FAM-HEX-TMRROX-LIZ和6FAM-VIC-NED-TAZ-SID-LIZ等熒光組合進(jìn)行引物標(biāo)記[1-2]，但因檢測(cè)系統(tǒng)中熒光通道（最多6色）的限制，相關(guān)試劑所能提供的基因座信息數(shù)量受到影響，使這些產(chǎn)品并不能完全滿足實(shí)際檢案的需求。為此，本研究以GA118-24B遺傳分析儀為檢測(cè)平臺(tái)，在前期8色熒光體系研究的基礎(chǔ)上[3]，經(jīng)進(jìn)一步對(duì)熒光能量轉(zhuǎn)移染料的篩選和熒光基團(tuán)標(biāo)記方式的優(yōu)化，建立了9色熒光分析體系，為國(guó)內(nèi)外首創(chuàng)。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該體系能顯著提高DNA檢測(cè)數(shù)據(jù)的信息量。

將每種熒光染料標(biāo)記而呈現(xiàn)特定顏色的一系列片段峰單獨(dú)區(qū)分出來，同時(shí)消除不同顏色間的干擾峰，這一處理過程稱為光譜分離[4]。STR自動(dòng)分型技術(shù)中，熒光檢測(cè)器對(duì)多色熒光信號(hào)檢測(cè)記錄時(shí)，實(shí)際上并不能以單波長(zhǎng)進(jìn)行，結(jié)果就使不同熒光染料之間存在明顯的光譜交叉重疊[5]。若大量存在因熒光干擾形成的偽峰，那么真正的擴(kuò)增產(chǎn)物片段就將難以正確識(shí)別，導(dǎo)致無法區(qū)分等位基因片段。因此，需要制備熒光校準(zhǔn)物，生成相關(guān)于遺傳分析儀的正確Matrix文件，使軟件在處理檢測(cè)信號(hào)后，經(jīng)計(jì)算互相重疊的不同顏色的光譜，能夠使各顏色通道之間互不干擾。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

9700型PCR熱循環(huán)儀（Thermo Fisher公司，美國(guó)）；GA118-24B遺傳分析儀（公安部第一研究所，中國(guó)）；9色熒光Matrix體系（公安部物證鑒定中心，中國(guó)）。

1.2 熒光染料的篩選

1）根據(jù)遺傳分析儀激光器的發(fā)射波長(zhǎng)和CCD范圍，9色熒光的發(fā)射波長(zhǎng)范圍確定在480～700 nm之間。

2）9種熒光發(fā)射光譜能區(qū)分開且不相互滲透。

3）9種熒光發(fā)射強(qiáng)度盡可能均勻[6]。

1.3 模板DNA

以pUC18質(zhì)粒為模板，選取901至1150核苷酸位置，模板序列見圖1，擴(kuò)增9個(gè)不同大小的片段并用不同熒光標(biāo)記，制備Matrix熒光校正品。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank?數(shù)據(jù)庫獲取的pUC18堿基序列范圍，使用Primer Express?Software Version 3.0設(shè)計(jì)引物，正向引物起點(diǎn)為927核苷酸位置[7]，反向引物根據(jù)長(zhǎng)度分別設(shè)計(jì)，引物序列見表1。委托蘇州新海生物技術(shù)有限公司合成和熒光標(biāo)記，通過PCR擴(kuò)增制備出標(biāo)記各色熒光的目的條帶。

表1 引物序列Table 1 The sequences of related primers

1.5 靶DNA片段擴(kuò)增

熒光校正標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中應(yīng)包含F(xiàn)AM、TET、HEX、NED、ET1、ET2、ET3、ET4和ET5熒光染料標(biāo)記的DNA片段各一份，且各片段的分子量大小應(yīng)有一定的區(qū)分度，熒光染料信息見表2、圖2。以pUC18質(zhì)粒為模板，選取901至1150核苷酸位置，擴(kuò)增9個(gè)不同大小的片段并用9色熒光標(biāo)記，該9個(gè)片段的長(zhǎng)度在75～200 bp之間，臨近片段大小相互差異在10~15 bp之間。PCR總體積為20 μL，內(nèi)含2×PCR緩沖液 10 μL，引物混合物 2 μL，DNA 模板 1 ng，純水補(bǔ)至20 μL。熱循環(huán)參數(shù)為：95 ℃、11 min；94℃、45 s，59 ℃、2 min，72 ℃、1 min，共28次；60 ℃ 、30 min。擴(kuò)增產(chǎn)物 4 ℃ 保存。

表2 9種熒光染料激發(fā)及發(fā)射波長(zhǎng)范圍Table 2 Exciting and emitting wavelengths of the nine fluorescent dyes

1.6 Matrix樣品制備、電泳及數(shù)據(jù)分析

將擴(kuò)增獲得的9個(gè)熒光和長(zhǎng)度均不相同的DNA片段純化后混合備用。用GA118-24B遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳及數(shù)據(jù)收集，按照GA118-24B遺傳分析儀操作手冊(cè)進(jìn)行光譜矯正。染料集選擇“X9”，光譜校正標(biāo)準(zhǔn)選擇“MtxStd{GeneScan-SetX9}”。

取10 μL Matrix片段混合物與240 μL去離子甲酰胺混合，95 ℃、5 min，冰浴3 min。然后根據(jù)電泳結(jié)果中各熒光信號(hào)的強(qiáng)度，調(diào)整每個(gè)片段的混合比例，將各片段峰高調(diào)平。構(gòu)建的9色熒光分析Matrix文件，取名為DNATyper9C Matrix，將文件保存于默認(rèn)目錄。

2 結(jié)果

2.1 熒光染料的篩選結(jié)果

本研究對(duì)目前市面上常用于標(biāo)記引物的熒光染料進(jìn)行了分析和篩選，根據(jù)GA118-24B遺傳分析儀的激光發(fā)射波長(zhǎng)及CCD檢測(cè)范圍，最終確定了FAM、TET、HEX、NED、ET1、ET2、ET3、ET4和ET5 9種熒光染料用于標(biāo)記引物及內(nèi)標(biāo)，其中后5色熒光染料均應(yīng)用了熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)。

2.2 9色熒光Matrix電泳結(jié)果

本研究研制的9色熒光標(biāo)準(zhǔn)物所構(gòu)建的DNATyper9C Matrix以GA118-24B遺傳分析儀電泳，結(jié)果見圖3。

2.3 Matrix數(shù)值表

在檢測(cè)設(shè)備和條件基本不變的情況下，不同顏色熒光染料之間的光譜重疊在強(qiáng)度比例上是基本穩(wěn)定的，各種熒光染料交叉干擾的程度可以用一個(gè)矩陣數(shù)值表定量描述。這樣一個(gè)定量表現(xiàn)熒光片段峰中各種顏色信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)比例關(guān)系的數(shù)值表，即為STR熒光標(biāo)記檢測(cè)分析技術(shù)之Matrix數(shù)值表，由此表構(gòu)成的相應(yīng)計(jì)算機(jī)文件稱作Matrix文件。

本研究獲得的Matrix數(shù)值表見表3。

表3 9色熒光Matrix數(shù)值表Table 3 The nine-dye fluorescent matrix and related values

3 討論

熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物以遺傳分析儀檢測(cè)，由于不同顏色熒光染料在同一激發(fā)波長(zhǎng)下其發(fā)射波長(zhǎng)相互間有干擾，在鄰近色道會(huì)出現(xiàn)一個(gè)干擾峰（pull-up peak），為此需要有一個(gè)Matrix文件，以確定主光譜峰，消除雜色峰。新熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增體系的開發(fā)與應(yīng)用都需要?jiǎng)?chuàng)建一個(gè)新的Matrix光譜校正文件[8]，該Matrix文件的好壞是評(píng)估一個(gè)多色熒光系統(tǒng)是否能夠成功建立的關(guān)鍵指標(biāo)之一。

理想的熒光染料，光譜范圍應(yīng)較窄，每種熒光代表一種引物片段，檢測(cè)到某種熒光就意味著檢測(cè)到某種引物片段，但實(shí)際情況是熒光染料的光譜范圍均較寬，當(dāng)光譜范圍出現(xiàn)重疊的時(shí)候，無法區(qū)分哪一部分光譜來自哪種熒光染料，導(dǎo)致STR片段無法被識(shí)別。為解決此問題，就需要在STR檢測(cè)之前，進(jìn)行光譜校正處理，建立熒光染料光譜分布矩陣，對(duì)STR數(shù)據(jù)處理進(jìn)行實(shí)時(shí)校正[9]。不同遺傳分析儀光譜矯正的數(shù)據(jù)采集和算法處理不同，但最終的目的都是為了消除干擾信號(hào)，只保留單一、最強(qiáng)的顏色峰。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）廣泛用于生物和化學(xué)研究中的熒光增強(qiáng)。當(dāng)供體熒光團(tuán)（donor-fluorophore，D-F）的發(fā)射波譜與受體熒光團(tuán)（acceptor-florophore，A-F）的吸收光譜有一定重疊時(shí)，由于遠(yuǎn)程偶極間的相互作用，熒光共振能量可以從激發(fā)態(tài)的D-F通過非輻射過程轉(zhuǎn)移到基態(tài)A-F。也就是說，當(dāng)D-F的發(fā)射波譜與A-F的吸收波譜有一定重疊時(shí)，用D-F的最優(yōu)激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)D-F，D-F釋放的能量會(huì)被A-F吸收，最終得到A-F的發(fā)射波長(zhǎng)。一個(gè)有效的FRET過程，D-F和A-F的距離為10～100 ?，此外，光譜重疊度越高，F(xiàn)RET越有效。

本研究9種染料的篩選應(yīng)滿足2個(gè)條件：

1）熒光發(fā)射能區(qū)分開且互不滲透。

2）熒光發(fā)射強(qiáng)度均勻。

對(duì)于第1個(gè)條件，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和現(xiàn)有試劑盒的波長(zhǎng)分析，熒光能區(qū)分開，需要染料的發(fā)射波長(zhǎng)間隔至少在20 nm以上，目前市面上常用于法醫(yī)檢測(cè)試劑盒的熒光染料，F(xiàn)AM發(fā)射波長(zhǎng)最短（520 nm），Cy5發(fā)射波長(zhǎng)最長(zhǎng)（650～660 nm），要從這兩個(gè)波長(zhǎng)范圍中，再添加7個(gè)波長(zhǎng)的染料，勢(shì)必會(huì)出現(xiàn)發(fā)射波長(zhǎng)間隔不足20 nm、滲透易見的情況，所以合成新的長(zhǎng)波長(zhǎng)染料是首要解決的問題。

對(duì)于第2個(gè)條件，由于現(xiàn)有的遺傳測(cè)序儀（ABI 3500/3130或GA118系列），采用的都是固態(tài)激光作為激發(fā)光源，激發(fā)波長(zhǎng)為488/505 nm的混合激光，一般的熒光染料沒有如此大的斯托克斯位移，單熒光團(tuán)標(biāo)記很難實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，故需要采用FRET標(biāo)記，從而使標(biāo)記的熒光團(tuán)信號(hào)增強(qiáng)，能實(shí)現(xiàn)9種熒光發(fā)射信號(hào)的均一性。

本研究通過大量實(shí)驗(yàn)探索了多種熒光染料組合，經(jīng)考慮信號(hào)強(qiáng)度、信號(hào)均一性，特別是染料間信號(hào)干擾消除以及與現(xiàn)有方法的通用性、延續(xù)性等方面的因素后，最終確定了一套9色熒光染料組合：FAM-190 bp、TET-175 bp、HEX-160 bp、NED-145 bp、ET1-130 bp、ET2-120 bp、ET3-105 bp、ET4-90 bp和ET5-75 bp。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)及驗(yàn)證結(jié)果，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)如下：

1）在選擇熒光染料前，務(wù)必要先了解所使用儀器激光束激發(fā)波長(zhǎng)及CCD的檢測(cè)范圍，以確保熒光染料的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)在儀器的檢測(cè)范圍內(nèi)。

2）另一個(gè)需考慮的關(guān)鍵因素是熒光染料的物理和化學(xué)性質(zhì)，由于熒光染料是疏水性很強(qiáng)的分子，在親水溶液中的聚集和堿性溶液中的降解均會(huì)影響其檢測(cè)效率，而且PCR需要在95 ℃和59 ℃ 之間進(jìn)行熱循環(huán)，因此，染料穩(wěn)定性也是一個(gè)重要的篩選參數(shù)。

3）關(guān)于Matrix制備國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道，Matrix制作主要應(yīng)關(guān)注染料波長(zhǎng)和熒光間的相互滲透干擾問題。經(jīng)對(duì)不同廠家的5色/6色試劑盒Matrix測(cè)試，發(fā)現(xiàn)片段長(zhǎng)度間隔集中在10～30 bp間、不同熒光標(biāo)記的片段間隔大小及其均勻性對(duì)于Matrix文件效果并無太大影響。引物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵在于最大片段不超過200 bp。因?yàn)槿羝翁螅赡軙?huì)在儀器程序設(shè)定的時(shí)間內(nèi)，Matrix片段出峰不完全，或者大片段峰型變寬，從而造成片段分析不準(zhǔn)確。因此，可根據(jù)熒光顏色數(shù)和實(shí)驗(yàn)需要而設(shè)計(jì)適當(dāng)大小的Matrix片段引物。

4）當(dāng)更換緩沖液、毛細(xì)管、激光管、熒光檢測(cè)器等物件時(shí)，應(yīng)重新建立Matrix文件。

5）9色熒光體系如果標(biāo)記的是單純的常染色體STR，可以組合40～50個(gè)基因座，但若是常+Y模式則可以組合60個(gè)以上基因座，比傳統(tǒng)的5色/6色熒光標(biāo)記要多10～20個(gè)以上基因座，系統(tǒng)效能大幅提升。

本研究為解決國(guó)產(chǎn)試劑研發(fā)中使用新染料時(shí)不同顏色熒光標(biāo)記的基因座間相互滲透的難題提供了新路徑與參考。方法操作簡(jiǎn)單，模板易獲得，成功率高，只需將不同染料標(biāo)記于對(duì)應(yīng)的引物上進(jìn)行擴(kuò)增、純化和混合調(diào)平即可用于遺傳分析儀的光譜矯正。本研究是提升國(guó)產(chǎn)化DNA檢驗(yàn)試劑水平與自主創(chuàng)新能力的一次成功實(shí)踐。