高林林，顧露芽，徐紅偉，徐 亮，王國(guó)輝

（1. 杭州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，杭州 310006；2. 淳安縣公安司法鑒定中心，浙江 淳安 311700；3. 建德市公安局，浙江 建德 311600）

DNA二次轉(zhuǎn)移，是指已經(jīng)轉(zhuǎn)移到一個(gè)物品或個(gè)體的DNA又被轉(zhuǎn)移到了另一個(gè)物品或個(gè)體上；抑或被轉(zhuǎn)移到同一物品或個(gè)體的其他部位處。接觸性生物檢材中脫落細(xì)胞的二次轉(zhuǎn)移在法醫(yī)DNA鑒定中愈發(fā)為法醫(yī)DNA檢驗(yàn)者所重視，樣本包裝及保存、污染排查、數(shù)據(jù)分析等都會(huì)涉及這一問題[1-3]。國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在接觸、洗滌過程中均會(huì)發(fā)生上皮細(xì)胞DNA的二次轉(zhuǎn)移[4-5]，國(guó)內(nèi)張松、霍塞虎等學(xué)者也對(duì)手部脫落細(xì)胞的二次轉(zhuǎn)移進(jìn)行了專門研究，證實(shí)二次轉(zhuǎn)移對(duì)DNA檢驗(yàn)鑒定確有影響[6-7]。本文通過對(duì)一起涉及性侵案件中精子細(xì)胞的DNA檢驗(yàn)及其二次轉(zhuǎn)移的分析，證實(shí)了精子細(xì)胞二次轉(zhuǎn)移的發(fā)生，從而改變了該案的偵查方向。本文還對(duì)相關(guān)研究和實(shí)踐的注意事項(xiàng)與參考借鑒進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 檢材來(lái)源

2020年本實(shí)驗(yàn)室受理的一起發(fā)生于2002年的某女被殺案中所提取的死者內(nèi)褲布片、血樣及其母親的口腔樣本。

1.2 首次檢驗(yàn)情況

1.2.1 檢材取樣及確證實(shí)驗(yàn)

送檢的內(nèi)褲布片為單層、幅面較寬，可排除其為內(nèi)褲襠部區(qū)域。肉眼觀察未發(fā)現(xiàn)其上有明顯斑跡，隨機(jī)剪取2處布片（大小均為1.0 cm×1.0 cm左右）并分別裝入1.5 mL離心管，加入雙蒸水200 μL，室溫靜置30 min，按行標(biāo)GA/T 766-2020《人精液PSA檢測(cè)金標(biāo)試劑條法》進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 樣本編號(hào)及DNA檢驗(yàn)

將上述2份檢材采用差異裂解法處理，第一次孵育完畢，高速離心后收集其上清液（編號(hào)為W1-1-F、W1-2-F）使用全自動(dòng)24道微量DNA提取工作站（寧波市博坤生物科技有限公司）提取DNA，沉淀（編號(hào)為W1-1-C、W1-2-C）及消化后的布片載體（編號(hào)為W1-1-Z、W1-2-Z）繼續(xù)進(jìn)行孵育裂解，獲得的DNA消化液與死者血樣（編號(hào)為R1）均使用前述自動(dòng)工作站提取DNA。以VersaPlexTM27PY System及YfilerTMPlus試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物均采用3500XL基因分析儀電泳。所得全部數(shù)據(jù)采用GeneMapperTMID-X軟件進(jìn)行分析。

1.3 復(fù)核檢驗(yàn)情況

1.3.1 檢材復(fù)核取樣及確證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)首次檢驗(yàn)數(shù)據(jù)分析判斷的情況，補(bǔ)充采集死者母親的樣本進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)內(nèi)褲布片作復(fù)核檢驗(yàn)。本次取樣依然為盲取，剪取的布片大小與首次剪取相仿，但選擇的2處取樣部位盡量遠(yuǎn)離第一次取樣部位。將剪取的布片先取適量，采用酸性品紅亞甲基藍(lán)染色法染色涂片后顯微鏡（10×40倍）下觀察是否附著有精子細(xì)胞。

1.3.2 樣本編號(hào)及DNA復(fù)核檢驗(yàn)

本次剪取的2份檢材在采用差異裂解法時(shí)將消化時(shí)間延長(zhǎng)至過夜，收集到的上清液（編號(hào)為W1-3-F、W1-4-F）、沉淀（編號(hào)為W1-3-C、W1-4-C）及消化后的布片載體（編號(hào)為W1-3-Z、W1-4-Z）采用與1.2.2中相同的步驟提取DNA。死者母親比對(duì)樣本采用Chelex-100法提取DNA。

上述提取的DNA樣本及死者DNA樣本采用PowerPlex?Fusion6C試劑盒進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增，死者母親樣本采用VersaPlexTM27PY System進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增，電泳及數(shù)據(jù)分析均與1.2.2中相同。

2 結(jié)果

2.1 確證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

首次檢驗(yàn)剪取的兩份檢材PSA試劑條檢驗(yàn)結(jié)果均呈陰性。復(fù)核檢驗(yàn)剪取的另兩份檢材在顯微鏡下均觀察到在布片纖維上附著有粉染的精子頭。

2.2 常染色體STR結(jié)果

經(jīng)過兩輪取樣檢驗(yàn)，內(nèi)褲布片差異裂解收集的上清液及沉淀均未獲得STR數(shù)據(jù)，消化后的布片載體（編號(hào)為W1-1-Z、W1-2-Z、W1-3-Z、W1-4-Z）均獲得同一個(gè)男性的DNA分型。其中W1-1-Z樣本在大片段有個(gè)別基因座未檢出基因分型；W1-2-Z樣本在Penta E基因座的分型為10/12，峰值較低，RFU值僅約為500；W1-3-Z樣本、W1-4-Z樣本在Penta E基因座基因分型均為10/18，RFU值在3 000~3 500。死者血樣經(jīng)過兩次檢驗(yàn)及平行擴(kuò)增，CSF1PO基因座的基因分型均為12。表1為內(nèi)褲布片（W1-4-Z）、死者血樣及死者母親樣本的檢驗(yàn)結(jié)果。

表1 常染色體STR相關(guān)數(shù)據(jù)Table 1 Autosomal STR data from the tested materials

2.3 Y染色體STR結(jié)果

消化后的布片載體上所獲得的Y-STR基因型顯示與辦案單位提供的死者哥哥的基因型（YfilerTM試劑盒）在17個(gè)基因座上相同。

2.4 數(shù)據(jù)分析結(jié)果

根據(jù)死者樣本、死者哥哥樣本（辦案單位提供的17個(gè)基因座分型結(jié)果）、死者母親樣本與內(nèi)褲布片檢材所獲得的常染色體STR分型，按照行標(biāo)GA/T 965-2011《法庭科學(xué)DNA親子鑒定規(guī)范》中不符合遺傳規(guī)律及標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體計(jì)算公式，所得父權(quán)指數(shù)均可達(dá)107以上，從遺傳學(xué)角度支持內(nèi)褲布片上測(cè)得的男性個(gè)體物質(zhì)源自于死者及其哥哥的生物學(xué)父親。

3 討論

3.1 陳舊性檢材的DNA檢驗(yàn)策略

無(wú)論是傳統(tǒng)的還是改良的差異裂解法，在檢驗(yàn)精子DNA時(shí)，都是去除載體后收集消化后的懸浮液[8-10]。本案的內(nèi)褲布片在兩次差異裂解收集的沉淀中均未檢出男性DNA物質(zhì)，這可能與該檢材在室溫放置了18年之久，且當(dāng)時(shí)因揉絞搓洗，精子細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)移而牢固附著于物證載體上不能有效分離下來(lái)有關(guān)。本案的成功檢驗(yàn)，提示陳舊性精斑檢材在采用差異裂解法時(shí)不能放棄對(duì)剩余載體同步提取DNA。

陳舊性生物檢材的另一顯著特點(diǎn)就是DNA會(huì)存在不同程度的降解。本案中死者血樣、內(nèi)褲布片所獲得的STR分型均呈現(xiàn)出小片段基因座峰值高、大片段基因座峰值低的倒三角降解特征。一般在分析此類大片段基因座的STR分型時(shí)較多地關(guān)注純合子的準(zhǔn)確性，而對(duì)于雜合子分型容易忽視。死者血樣在CSF1PO基因座的分型為12，且峰值較低；通過不同試劑盒的復(fù)核檢驗(yàn)后仍為12。內(nèi)褲布片在Penta E基因座的STR分型為10/12，在初始分析中，由于沒有出現(xiàn)其他雜峰，就只認(rèn)為是因擴(kuò)增片段太長(zhǎng)導(dǎo)致的峰值較低所致，對(duì)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性并沒有作過多考慮。但根據(jù)前期所得到的比對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入判斷時(shí)，才意識(shí)到該基因座分型可能有誤。經(jīng)過復(fù)核檢驗(yàn)，確認(rèn)該基因座的正確分型為10/18。因此針對(duì)陳舊性樣本，在進(jìn)行DNA檢驗(yàn)時(shí)，建議留備份檢材或備份DNA模板進(jìn)行復(fù)核檢驗(yàn)，并最好采用不同的擴(kuò)增試劑盒測(cè)試，以期獲得準(zhǔn)確的DNA分型結(jié)果。否則，可能會(huì)對(duì)STR數(shù)據(jù)的深入分析及案件的偵查方向產(chǎn)生誤導(dǎo)。

3.2 精子細(xì)胞二次轉(zhuǎn)移的判定及其表現(xiàn)特征

根據(jù)上述DNA檢驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合調(diào)查訪問，認(rèn)為內(nèi)褲布片上的精斑為精子細(xì)胞的二次轉(zhuǎn)移所致。依據(jù)在于：

1）通過顯微鏡觀察，確認(rèn)布片纖維上附著有精子細(xì)胞。因?yàn)镈NA提取過程中采用了差異裂解法去除了上皮細(xì)胞，而內(nèi)褲布片經(jīng)差異裂解收集的上清液及沉淀又均未獲得STR數(shù)據(jù)，表明本案所獲得的男性STR分型應(yīng)來(lái)源于附著在纖維上的精子細(xì)胞。

2）檢驗(yàn)結(jié)果支持精子供者為死者及其哥哥的生物學(xué)父親，但通過對(duì)死者家屬及周圍證人當(dāng)時(shí)的詢問調(diào)查，其父無(wú)作案時(shí)間，因此該精斑不可能為在案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)直接遺留于死者內(nèi)褲布片上。

3）通過深入詢問了解，死者內(nèi)褲是與其母親的內(nèi)褲混在一起由其母親洗滌，而死者父母親在當(dāng)時(shí)具有正常的夫妻性生活，因此死者母親內(nèi)褲上附著的死者父親的精斑就有機(jī)會(huì)經(jīng)由洗滌途徑轉(zhuǎn)移到死者內(nèi)褲上。國(guó)外學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)也證實(shí)精子細(xì)胞通過洗滌可轉(zhuǎn)移至其他衣物纖維上并能提供完整的DNA分型[11-12]。

在洗滌過程中，精子細(xì)胞及精漿等其他成分與最初附著的載體分離而懸浮及分散于洗滌液中，此洗滌液就作為中間介質(zhì)而使精子細(xì)胞從一個(gè)物品轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物品上。因此，通過洗滌方式發(fā)生二次轉(zhuǎn)移的精子細(xì)胞有以下幾個(gè)表征：

1）精子細(xì)胞呈散在性分布。有研究表明洗滌后的衣物上雖然看不到血斑，但通過分子生物學(xué)分析可獲得供者的完整DNA分型[13]。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了這一點(diǎn)。本案中的內(nèi)褲布片上肉眼觀察不到明顯的斑跡，檢驗(yàn)的4處布片均為盲取且部位比較分散，但均檢出相同的結(jié)果。這說明二次轉(zhuǎn)移的精子細(xì)胞在檢材載體上為散在性分布。

2）精子細(xì)胞獨(dú)立存在。精液中含有的其他蛋白類物質(zhì)會(huì)在洗滌液中分散懸浮或溶解，單位體積內(nèi)的含量就急劇下降。而洗滌劑中所含有的表面活性劑或酶會(huì)導(dǎo)致前列腺特異性抗原、酸性磷酸酶等成分發(fā)生變性或分解，從而導(dǎo)致精斑預(yù)實(shí)驗(yàn)或PSA檢驗(yàn)等結(jié)果為陰性，但通過精子染色法可觀察到獨(dú)立存在的粉染的精子頭。

3）與載體結(jié)合較為牢固。本案中的布片在差異裂解過程中經(jīng)過長(zhǎng)達(dá)24 h的振蕩孵育，精子細(xì)胞仍然附著于布片纖維上，說明轉(zhuǎn)移的精子細(xì)胞與載體的粘附較為牢固，這可能與手工洗滌過程中內(nèi)褲之間互相揉絞搓洗有關(guān)，而未粘附或粘附不牢固的細(xì)胞則會(huì)經(jīng)洗滌去除掉。

4）轉(zhuǎn)移后的細(xì)胞數(shù)量較少。根據(jù)顯微鏡下觀察到的精子數(shù)量以及DNA圖譜RFU值，推斷在洗滌過程中只有少量精子細(xì)胞發(fā)生了二次轉(zhuǎn)移。

3.3 啟示

精斑類檢材是法醫(yī)物證檢驗(yàn)中常見的類型，確證試驗(yàn)及DNA個(gè)體識(shí)別可作為法醫(yī)學(xué)中涉及性侵行為的定案依據(jù)。本案中在死者內(nèi)褲布片上檢出精子且獲得完整的DNA分型，若未進(jìn)行深入研判分析，極有可能會(huì)認(rèn)為是犯罪嫌疑人所遺留，從而給偵查人員提供錯(cuò)誤的偵查線索。因此，本案對(duì)法醫(yī)DNA檢驗(yàn)工作者可有以下幾點(diǎn)提示：

1）在生物檢材的DNA檢驗(yàn)中，應(yīng)加強(qiáng)與現(xiàn)場(chǎng)勘查及偵查人員的信息溝通，必要時(shí)可參與訪問，盡可能多了解、多掌握一些有關(guān)案件情況的細(xì)節(jié)。本案中通過與死者母親的幾次細(xì)致對(duì)話，了解到當(dāng)?shù)禺?dāng)時(shí)衣物洗滌的一些習(xí)慣及死者父母性生活的細(xì)節(jié)，為認(rèn)定內(nèi)褲布片上的精子細(xì)胞為二次轉(zhuǎn)移提供了可靠的判斷基礎(chǔ)。

2）每一個(gè)生物檢材在得到DNA的STR數(shù)據(jù)后，首先應(yīng)判定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，對(duì)一些不可靠的基因座分型結(jié)果應(yīng)及時(shí)進(jìn)行復(fù)核。其次在排除外源性污染的前提下，還應(yīng)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析及證據(jù)評(píng)估，有時(shí)就需要考慮DNA二次轉(zhuǎn)移的問題。本案中當(dāng)發(fā)現(xiàn)內(nèi)褲布片上的精子Y-STR分型與死者哥哥一致時(shí)，對(duì)該樣本常染色體STR分型與死者及其哥哥同其母親進(jìn)行親緣關(guān)系的進(jìn)一步分析，結(jié)果支持該內(nèi)褲布片上的精子供者為死者及其哥哥的生物學(xué)父親。這一結(jié)果使筆者意識(shí)到該DNA數(shù)據(jù)并非真正的嫌疑人所留，從而避免了該案出現(xiàn)偵查方向上的偏離。因此在沒有明顯斑跡的布片上檢出的精斑分型，在結(jié)果解釋上應(yīng)更為謹(jǐn)慎，因其也許并不是嫌疑人所留，可能只是洗滌后遺留在衣物上的正常性伴侶的物質(zhì)抑或是與案件無(wú)關(guān)人員的物質(zhì)經(jīng)洗滌導(dǎo)致二次轉(zhuǎn)移。

3）對(duì)涉及性侵行為的體外生物檢材的混合斑DNA檢驗(yàn)，規(guī)范性操作步驟及拓展檢驗(yàn)比如確證實(shí)驗(yàn)及上清液的DNA檢驗(yàn)都非常重要，這些結(jié)果不僅可指導(dǎo)復(fù)核檢驗(yàn)的方案制定，而且對(duì)生物檢材的DNA檢驗(yàn)結(jié)果的解讀也具有指向作用。本案中內(nèi)褲布片上檢見精子，差異裂解收集的上清液及沉淀均未檢出DNA分型，正是這一不尋常的結(jié)果，引起了對(duì)該檢材進(jìn)行復(fù)核檢驗(yàn)及深入分析。

4）本案中內(nèi)褲布片上精子被判定為細(xì)胞的二次轉(zhuǎn)移所致，因而使其失去了證明性侵行為的價(jià)值，但此發(fā)現(xiàn)同時(shí)又為法醫(yī)DNA生物檢材的查找拓展了新的思路，在某些涉及性侵的案件中，可通過檢驗(yàn)與受害者衣物共同洗滌過的載體上發(fā)現(xiàn)的精子細(xì)胞及DNA來(lái)獲得關(guān)于犯罪嫌疑人的偵查線索。