闕 雷，石紅喬，彭 陶，魏躍鋼

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院 南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001)

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痤瘡是由于肺胃積熱，長(zhǎng)期不愈，氣機(jī)不暢，而使痰濕內(nèi)生，血行瘀滯產(chǎn)生的皮膚疾患。南京市中醫(yī)院皮膚科治療室運(yùn)用中藥祛痘1號(hào)軟膜外敷治療痤瘡多年，取得較好的療效。該軟膜中藥成分是在古方“顛倒散”的基礎(chǔ)上辨證加減。軟膜組成為中藥粉及軟膜基質(zhì)。為了進(jìn)一步探索本藥治療痤瘡的原理，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察該藥對(duì)金黃地鼠背部皮脂腺斑組織大小、微觀結(jié)構(gòu)及增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 采用8周齡的雄性金黃地鼠(維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，清潔級(jí)，體重80～120 g；南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)(202012A021)。

PCNA(Affinity，AF0239)，PI3K抗體(Proteintech，20584-1-AP)，Akt抗體(Abcam，Ab-8805)，DAB(Dako Denmark，K3468)；中藥祛痘1號(hào)軟膜的中藥由黃連、大黃、茯苓、虎杖、苦參、丹參、血竭、硫磺組成，均采購于南京市中醫(yī)院中藥房。軟膜制備方法：以上八味藥物均取干燥藥材，按照3∶5∶5∶5∶5∶5∶2∶2的質(zhì)量比例混合，研成細(xì)粉，過300目篩。軟膜基質(zhì)是以海藻酸鈉粉、磷酸鎂粉、氯化鈣粉及生粉按比例混合而成。中藥粉和面膜基質(zhì)按質(zhì)量1∶9的比例混合備用；維胺酯維E乳膏(國藥準(zhǔn)字H20059598)；游標(biāo)卡尺(上海恒量量具)，顯微鏡(NIKON，H550S)，成像系統(tǒng)(NIKON，DS-RI2)。

1.2 動(dòng)物模型制備與分組干預(yù) 選取金黃地鼠背部皮脂腺斑塊作為痤瘡模型，將32只雄性金黃地鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，分為四組?？瞻捉M：予0.9%氯化鈉溶液每日1次搽拭皮脂腺斑塊；軟膜基質(zhì)組：予基質(zhì)外敷30 min后擦去；中藥軟膜組：予以中藥軟膜外敷30 min后揭去；陽性對(duì)照組：予維胺酯維E乳膏每日1次外用。在干預(yù)后第15天，進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.3 皮脂腺斑面積測(cè)量 首次藥物干預(yù)前及末次藥物干預(yù)1 d后，用剃刀剃光金黃地鼠背部雙側(cè)毛發(fā)，充分暴露皮脂腺斑，在光線充足的環(huán)境下，利用游標(biāo)卡尺測(cè)量皮脂腺斑塊的最大橫徑(DT)和最大縱徑(DL)，兩個(gè)數(shù)值相乘，分別計(jì)算出雙側(cè)皮脂腺斑的面積。皮脂腺面積=DT(mm)×DL(mm)。

1.4 HE染色觀察皮脂腺斑病理結(jié)構(gòu) 在藥物干預(yù)后第15天，將動(dòng)物處死，取金黃地鼠背部皮脂腺斑組織，4%多聚甲醛固定后經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片行HE染色，顯微鏡下觀察皮脂腺大小、厚度及松散程度。

1.5 免疫組化檢測(cè)皮脂腺斑PCNA、PI3K、Akt表達(dá) 將制備的皮脂腺斑組織切片先后進(jìn)行脫蠟、水化、抗原修復(fù)、封閉、分別予以PCNA、PI3K、Akt一抗孵育、相應(yīng)種屬的二抗孵育后，進(jìn)行DAB顯色反應(yīng)，鏡下觀察各組表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 各組金黃地鼠皮脂腺斑面積比較 見表1。干預(yù)前各組皮脂腺斑面積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在干預(yù)第8天時(shí)，各組面積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在干預(yù)第15天時(shí)，中藥軟膜組和陽性對(duì)照組的同側(cè)皮脂腺斑面積小于空白組、軟膜基質(zhì)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 中藥軟膜組和陽性對(duì)照組皮脂腺斑的面積相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組金黃地鼠雙側(cè)皮脂腺斑面積比較(mm2)

2.2 各組金黃地鼠組織病理學(xué)表現(xiàn) 空白組：金黃地鼠皮脂腺呈分葉狀分布，腺體飽滿，數(shù)量多，排列緊密而厚；軟膜基質(zhì)組：部分皮脂腺較大，排列緊厚；中藥軟膜組：皮脂腺腺體厚度較空白組變薄，腺體體積變小，排列疏松；陽性對(duì)照組：皮脂腺腺體萎縮，數(shù)量少。中藥軟膜組的腺體排列較空白組、軟膜基質(zhì)組松散，腺體變小且數(shù)目減少，與陽性對(duì)照組效果接近(圖1)。

圖1 各組金黃地鼠皮脂腺組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE染色)

2.3 各組金黃地鼠PCNA蛋白表達(dá)情況 PCNA蛋白是細(xì)胞增殖狀態(tài)的觀察指標(biāo)，定位在細(xì)胞核的位置，陽性細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色。每張切片任意選取 5 個(gè)陽性區(qū)域的高倍視野。與空白組、軟膜基質(zhì)組相比較，中藥軟膜組和陽性對(duì)照組整體PCNA的表達(dá)都有所下降，其中陽性對(duì)照組更為明顯?？瞻捉M與軟膜基質(zhì)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；中藥軟膜組、陽性對(duì)照組皮脂腺斑PCNA表達(dá)比空白組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中藥軟膜組和陽性對(duì)照組PCNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 見圖2(表2)。

圖2 各組金黃地鼠皮脂腺PCNA免疫組化染色

表2 各組金黃地鼠皮脂腺PCNA免疫組化染色OD值

2.4 各組金黃地鼠PI3K、Akt的蛋白表達(dá)情況 PI3K、Akt抗體的染色定位在細(xì)胞核及細(xì)胞漿，呈現(xiàn)棕黃色的即陽性細(xì)胞。通過DAB顯色反應(yīng)，鏡下觀察可見空白組和軟膜基質(zhì)組的陽性細(xì)胞數(shù)量多于中藥軟膜組和陽性對(duì)照組，并且顏色深，面積大。與空白組、軟膜基質(zhì)組相比較，中藥軟膜組和陽性對(duì)照組整體PI3K、Akt的蛋白表達(dá)都有所下降，其中陽性對(duì)照組更為明顯(圖3、4)。

圖3 各組金黃地鼠皮脂腺PI3K免疫組化染色

3 討 論

現(xiàn)代研究顯示，雄激素作用下皮膚的皮脂腺及其調(diào)控分泌的脂質(zhì)功能異常，以及微生物感染等因素是引發(fā)痤瘡的機(jī)制之一[1-3]。研究結(jié)果顯示多條通路與脂質(zhì)代謝有關(guān)，這些通路的激活能引起脂質(zhì)的異常分泌。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)是可以影響脂質(zhì)代謝的重要因子[4-5]，該因子可以調(diào)節(jié)下游多種脂質(zhì)合成酶基因的表達(dá)，從而能夠影響脂質(zhì)代謝[6-7]。

黃秋紅等[8]通過雄激素激活HaCaT細(xì)胞的SREBP信號(hào)通路，再運(yùn)用PI3K/Akt通路抑制劑干預(yù)，研究結(jié)果顯示PI3K/Akt信號(hào)通路在雄激素激活HaCaT細(xì)胞的SREBP信號(hào)通路過程中起到重要作用。丁暢等[9]研究發(fā)現(xiàn)通過荷葉堿的干預(yù)，可以抑制細(xì)胞的PI3K/Akt/mTOR通路，達(dá)到降低細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的合成。在眾多與脂質(zhì)代謝相關(guān)聯(lián)的因素中，PI3K/Akt信號(hào)通路是重要的一個(gè)部分，該通路與細(xì)胞的增殖、代謝過程有著緊密的關(guān)系[10]。因此，我們可以通過藥物干預(yù)皮脂腺細(xì)胞中PI3K/Akt通路，調(diào)節(jié)皮脂合成和分泌，從而達(dá)到治療痤瘡的目的。PCNA存在于正常增殖細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞增殖的啟動(dòng)上起重要作用，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的良好指標(biāo)[11]。在痤瘡患者的皮損中，炎性細(xì)胞的浸潤和微生物的感染，均可能引起皮脂腺細(xì)胞增殖，激活PCNA。在本研究中，我們通過觀察中藥軟膜干預(yù)前后皮脂腺組織細(xì)胞PCNA表達(dá)情況變化，以研究中藥1號(hào)祛痘軟膜的療效是否跟感染細(xì)胞DNA增殖有關(guān)系。

研究選擇金黃地鼠作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)象，是因?yàn)槠浔巢康钠ぶ侔呤翘烊坏难芯科ぶ俟δ艿膭?dòng)物模型，該模型也被國內(nèi)外認(rèn)可[12]。顧煒等[13]在研究藥物對(duì)皮脂腺功能影響時(shí)，也曾采用金黃地鼠背部的皮脂腺斑作為動(dòng)物模型，取得較好的觀察效果。對(duì)照組藥物維胺酯維E軟膏是臨床治療尋常痤瘡的常用藥物，其藥物功效包括可以抑制皮膚的脂質(zhì)分泌。

中醫(yī)學(xué)一般認(rèn)為痤瘡多與肺胃積熱有關(guān)，若長(zhǎng)期不愈，則氣機(jī)不暢，易導(dǎo)致痰濕內(nèi)生，血行瘀滯。祛痘1號(hào)軟膜的中藥組方在臨床已經(jīng)使用多年，前期曾有過臨床研究資料。張倩等[14]也曾觀察過此中藥組方的散劑治療尋常痤瘡的臨床療效，取得了滿意的效果。

中藥組方中大黃清熱瀉火、祛瘀解毒，為君藥。黃連清熱解毒，苦參清熱燥濕，為臣藥。虎杖利濕、散瘀，血竭、丹參皆能活血化瘀、止痛，茯苓健脾除濕，硫磺則具有解毒殺蟲之效，共為佐藥。而很多現(xiàn)代研究結(jié)果也表明，中藥在抑制痤瘡丙酸桿菌、抑制皮脂分泌等方面有著很好的效果。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)：黃連提取物可抗炎抑菌;大黃具有廣譜抗菌和免疫調(diào)節(jié)的作用[15-16]；硫磺與人體皮膚分泌物作用生成硫化物，可起到軟化皮膚角質(zhì)，抑制皮脂的功效[17]。有現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究報(bào)道黃芩苷等藥物可抑制皮脂腺細(xì)胞的活性[18-19]。本研究的軟膜屬膠膜型面膜，軟膜的成型原理是將溶于水的海藻酸鈉與鎂鹽作用，變成不溶于水的海藻酸鎂[20]。在用水調(diào)和軟膜粉外敷在痤瘡部位時(shí)，可以控制水分緩緩釋放，加強(qiáng)皮膚的水合作用，促進(jìn)中藥成分的透皮吸收，增加治療效果。

在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)與空白組和軟膜基質(zhì)組相比，中藥軟膜組的大鼠背部皮脂腺斑塊面積明顯縮小，皮脂腺厚度變薄，腺體體積變小，排列疏松。其PCNA表達(dá)降低，凋亡增加，也說明了皮脂腺細(xì)胞的增殖受到抑制。PI3K、Akt表達(dá)下調(diào)，提示了中藥1號(hào)軟膜治療痤瘡的機(jī)制，可能跟對(duì)PI3K/Akt通路的抑制有關(guān)聯(lián)。而這幾項(xiàng)觀察指標(biāo)結(jié)果中，中藥1號(hào)祛痘軟膜組和陽性對(duì)照組相接近。綜上所述，中藥祛痘1號(hào)軟膜可有效抑制皮脂腺增生，為軟膜用于臨床治療痤瘡提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。