張平，俞鶯，胡楓，陳宏翔

(1.武漢市第一醫(yī)院皮膚科，武漢 430022；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，武漢 430030；3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科，武漢 430022)

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)BALB/c雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2017-0012，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：No.42010200006609。飼養(yǎng)條件：恒溫23 ℃，相對(duì)濕度50%～60%；晝夜各12 h交替，小鼠自由攝取食物飲水。

1.2材料與儀器 轉(zhuǎn)移緩沖液Transcription Factor Buffer Set(BD PharmingenTM，批號(hào)：562574)；小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒(天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?，批?hào)：LTS1092)；BD培養(yǎng)基(佛波酯50 ng·mL-1、離子霉素500 ng·mL-1、莫能霉素1 μg·mL-1，上海金畔生物科技有限公司)，APC anti-mouse IL-17A抗體(美國(guó)Biolegend公司，批號(hào)：506915)；FITC anti-mouse CD4 抗體(美國(guó)Biolegend公司，批號(hào)：100405)；PE anti-mouse CD3 抗體(美國(guó)Biolegend公司，批號(hào)：100205)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckmancoulter公司，型號(hào)：CytoFLEX)；低速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf，型號(hào)：5702R)?？俁NA提取試劑(Trizol，Ambion公司，批號(hào)：15596-026)；SYBR Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司，批號(hào)：Q111-02)；Taq Plus DNA 聚合酶[天根生化科技(北京)有限公司，批號(hào)：ET105-01]；DL2000 DNA Marker[天根生化科技(北京)有限公司，批號(hào)：MD114-02]；焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：R1600)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀[美國(guó)Applied Biosystems(ABI)公司，型號(hào)：QuantStudio 6]。5%咪喹莫特(imiquimod，IMQ)軟膏(湖北科益藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：210801)。

1.3動(dòng)物分組與模型的建立 取小鼠20只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組與正常對(duì)照組各10只。兩組均刮除背部皮毛，裸露部位皮膚面積3 cm×3 cm，裸露部位每天9：00局部給藥，攝影記錄皮膚變化。模型組皮膚涂抹5%IMQ軟膏60 mg·d-1，連續(xù)7 d，制備銀屑病樣皮炎模型；正常對(duì)照組不處理。銀屑病樣皮炎小鼠成模標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5]，銀屑病面積與嚴(yán)重度指數(shù)(psoriasis area and severity index，PASI)評(píng)分0～4分。紅斑：無(wú)，0分；淡紅，1分；紅色，2分；深紅，3分；紫紅，4分。鱗屑：無(wú)，0分；局部細(xì)薄鱗屑，1分；多數(shù)皮損表面片狀鱗屑，2分；幾乎全部皮損表面較厚鱗屑，3分；全部皮損表面很厚鱗屑堆積，4分。皮膚增厚：無(wú)，0分；略高于正常皮膚，1分；中等程度隆起，2分；明顯肥厚隆起，3分；高度肥厚、隆起極為明顯，4分。三項(xiàng)積分之和為累積得分。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1成模情況 見(jiàn)圖1。連續(xù)涂抹5%IMQ軟膏7 d，模型組小鼠背部皮膚逐漸形成浸潤(rùn)性暗紅斑片，表面覆著成層白色鱗屑，皮膚厚度增加；第3天和第7天平均PASI評(píng)分分別為4.8和9分；組織切片蘇木精-伊紅(HE)染色(×400)顯示表皮角化過(guò)度，棘層增厚，皮突延長(zhǎng)，真皮淺層血管增生、擴(kuò)張及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；HE染色(×100)見(jiàn)表皮增厚，真皮淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張，真皮深層及皮下組織內(nèi)見(jiàn)較多圓形、橢圓形毛囊斷面。正常對(duì)照組小鼠背部皮膚光滑平整。

a.模型組；b.正常對(duì)照組；c.模型組HE染色(×400)；d.模型組HE染色(×100)。

a.模型組總細(xì)胞(藍(lán)色方框)；b.模型組細(xì)胞(右上象限)；c.正常對(duì)照組總細(xì)胞；d.正常對(duì)照組細(xì)胞。

a.模型組總細(xì)胞；b.模型組細(xì)胞；c.正常對(duì)照組總細(xì)胞；d.正常對(duì)照組細(xì)胞。

2.4Tc17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平 見(jiàn)圖4。以2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，與正常對(duì)照組比較，模型組流式分選收集的Tc17細(xì)胞中IL-17A與RORγt表達(dá)水平顯著增高，分別為(3.13±0.49)[正常對(duì)照組(0.95±0.21)，t=-9.05，P<0.01]和(3.35±0.22)[正常對(duì)照組(1.09±0.27)，t=-14.51，P<0.01]。模型組Tc17細(xì)胞IL-22及STAT3表達(dá)量分別為(2.41±0.22)[正常對(duì)照組(1.11±0.10)，t=-12.21，P<0.01]和(2.02±0.40)[正常對(duì)照組(0.89±0.17)，t=-5.78，P<0.01]。

①與正常對(duì)照組比較，P<0.01。

3 討論

銀屑病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，固有免疫和適應(yīng)性免疫均參與其中。動(dòng)物模型的建立為研究其潛在發(fā)病機(jī)制和開(kāi)展藥物治療提供了有利平臺(tái)。本研究結(jié)果顯示，5%IMQ軟膏誘導(dǎo)形成銀屑病樣皮炎小鼠模型與尋常型銀屑病患者的皮損表現(xiàn)和組織病理改變相似程度高，外用IMQ第3天皮膚出現(xiàn)浸潤(rùn)性暗紅斑片，PASI評(píng)分平均值4.8分；第7天皮損明顯增厚，面積擴(kuò)大，表面片狀鱗屑增多，PASI評(píng)分平均值9分，說(shuō)明銀屑病樣皮炎小鼠皮膚模型造模成功。銀屑病動(dòng)物模型主要有誘導(dǎo)性、自發(fā)突變性、轉(zhuǎn)基因及異體移植模型[6]。誘導(dǎo)模型常見(jiàn)有藥物涂抹在動(dòng)物如豚鼠、小鼠皮膚上誘發(fā)銀屑病樣增生；自發(fā)性包括鱗片狀皮膚突變鼠、慢性增殖性皮炎或缺皮脂突變鼠等。各類模型均不能全面反映銀屑病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，誘導(dǎo)動(dòng)物模型能引起免疫調(diào)控因子變化，并促使炎性反應(yīng)及損傷發(fā)生。IMQ是Toll樣受體激動(dòng)劑，可通過(guò)刺激TLR7/8激活天然免疫并進(jìn)一步激發(fā)適應(yīng)性免疫。研究表明[7]，IMQ誘導(dǎo)的皮炎部分依賴于T細(xì)胞的存在，在IL-23或IL-17受體缺失的小鼠，疾病發(fā)展幾乎完全受阻，IL-23/IL-17軸在銀屑病樣皮炎發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，Tc17細(xì)胞參與銀屑病樣皮膚炎癥過(guò)程，且Tc17與Th17細(xì)胞促進(jìn)銀屑病發(fā)病的部分信號(hào)通路相似。本實(shí)驗(yàn)初步分析了銀屑病樣小鼠血液中Tc17細(xì)胞比例及其表達(dá)相關(guān)細(xì)胞因子狀況，尚缺乏Tc17和Th17細(xì)胞相互關(guān)系的研究及Tc17細(xì)胞亞型的深入分類。在不同免疫病理狀態(tài)下，免疫細(xì)胞可分化為不同類型的亞群，Tc17細(xì)胞在特定極化條件下，還可向Tc1亞群轉(zhuǎn)化，深入研究 Tc17的功能和分化機(jī)制，可為進(jìn)一步探索銀屑病的復(fù)雜機(jī)制提供新思路。