張平，俞鶯，胡楓，陳宏翔

(1.武漢市第一醫(yī)院皮膚科，武漢 430022；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院風濕免疫科，武漢 430030；3.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科，武漢 430022)

1 材料與方法

1.1實驗動物 6～8周齡無特定病原體(SPF)級BALB/c雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由三峽大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2017-0012，實驗動物合格證號：No.42010200006609。飼養(yǎng)條件：恒溫23 ℃，相對濕度50%～60%；晝夜各12 h交替，小鼠自由攝取食物飲水。

1.2材料與儀器 轉(zhuǎn)移緩沖液Transcription Factor Buffer Set(BD PharmingenTM，批號：562574)；小鼠外周血淋巴細胞分離液試劑盒(天津灝洋生物制品科技有限公司，批號：LTS1092)；BD培養(yǎng)基(佛波酯50 ng·mL-1、離子霉素500 ng·mL-1、莫能霉素1 μg·mL-1，上海金畔生物科技有限公司)，APC anti-mouse IL-17A抗體(美國Biolegend公司，批號：506915)；FITC anti-mouse CD4 抗體(美國Biolegend公司，批號：100405)；PE anti-mouse CD3 抗體(美國Biolegend公司，批號：100205)；流式細胞儀(美國Beckmancoulter公司，型號：CytoFLEX)；低速離心機(德國Eppendorf，型號：5702R)?？俁NA提取試劑(Trizol，Ambion公司，批號：15596-026)；SYBR Green Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司，批號：Q111-02)；Taq Plus DNA 聚合酶[天根生化科技(北京)有限公司，批號：ET105-01]；DL2000 DNA Marker[天根生化科技(北京)有限公司，批號：MD114-02]；焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC，北京索萊寶科技有限公司，批號：R1600)；實時熒光定量PCR儀[美國Applied Biosystems(ABI)公司，型號：QuantStudio 6]。5%咪喹莫特(imiquimod，IMQ)軟膏(湖北科益藥業(yè)股份有限公司，批號：210801)。

1.3動物分組與模型的建立 取小鼠20只，適應性喂養(yǎng)1周，采用隨機數(shù)字表法分為模型組與正常對照組各10只。兩組均刮除背部皮毛，裸露部位皮膚面積3 cm×3 cm，裸露部位每天9：00局部給藥，攝影記錄皮膚變化。模型組皮膚涂抹5%IMQ軟膏60 mg·d-1，連續(xù)7 d，制備銀屑病樣皮炎模型；正常對照組不處理。銀屑病樣皮炎小鼠成模標準參照文獻[5]，銀屑病面積與嚴重度指數(shù)(psoriasis area and severity index，PASI)評分0～4分。紅斑：無，0分；淡紅，1分；紅色，2分；深紅，3分；紫紅，4分。鱗屑：無，0分；局部細薄鱗屑，1分；多數(shù)皮損表面片狀鱗屑，2分；幾乎全部皮損表面較厚鱗屑，3分；全部皮損表面很厚鱗屑堆積，4分。皮膚增厚：無，0分；略高于正常皮膚，1分；中等程度隆起，2分；明顯肥厚隆起，3分；高度肥厚、隆起極為明顯，4分。三項積分之和為累積得分。

表1 引物序列

2 結果

2.1成模情況 見圖1。連續(xù)涂抹5%IMQ軟膏7 d，模型組小鼠背部皮膚逐漸形成浸潤性暗紅斑片，表面覆著成層白色鱗屑，皮膚厚度增加；第3天和第7天平均PASI評分分別為4.8和9分；組織切片蘇木精-伊紅(HE)染色(×400)顯示表皮角化過度，棘層增厚，皮突延長，真皮淺層血管增生、擴張及炎性細胞浸潤；HE染色(×100)見表皮增厚，真皮淺層毛細血管擴張，真皮深層及皮下組織內(nèi)見較多圓形、橢圓形毛囊斷面。正常對照組小鼠背部皮膚光滑平整。

a.模型組；b.正常對照組；c.模型組HE染色(×400)；d.模型組HE染色(×100)。

a.模型組總細胞(藍色方框)；b.模型組細胞(右上象限)；c.正常對照組總細胞；d.正常對照組細胞。

a.模型組總細胞；b.模型組細胞；c.正常對照組總細胞；d.正常對照組細胞。

2.4Tc17細胞相關細胞因子表達水平 見圖4。以2-ΔΔCt法計算相對表達量，與正常對照組比較，模型組流式分選收集的Tc17細胞中IL-17A與RORγt表達水平顯著增高，分別為(3.13±0.49)[正常對照組(0.95±0.21)，t=-9.05，P<0.01]和(3.35±0.22)[正常對照組(1.09±0.27)，t=-14.51，P<0.01]。模型組Tc17細胞IL-22及STAT3表達量分別為(2.41±0.22)[正常對照組(1.11±0.10)，t=-12.21，P<0.01]和(2.02±0.40)[正常對照組(0.89±0.17)，t=-5.78，P<0.01]。

①與正常對照組比較，P<0.01。

3 討論

銀屑病發(fā)病機制復雜，固有免疫和適應性免疫均參與其中。動物模型的建立為研究其潛在發(fā)病機制和開展藥物治療提供了有利平臺。本研究結果顯示，5%IMQ軟膏誘導形成銀屑病樣皮炎小鼠模型與尋常型銀屑病患者的皮損表現(xiàn)和組織病理改變相似程度高，外用IMQ第3天皮膚出現(xiàn)浸潤性暗紅斑片，PASI評分平均值4.8分；第7天皮損明顯增厚，面積擴大，表面片狀鱗屑增多，PASI評分平均值9分，說明銀屑病樣皮炎小鼠皮膚模型造模成功。銀屑病動物模型主要有誘導性、自發(fā)突變性、轉(zhuǎn)基因及異體移植模型[6]。誘導模型常見有藥物涂抹在動物如豚鼠、小鼠皮膚上誘發(fā)銀屑病樣增生；自發(fā)性包括鱗片狀皮膚突變鼠、慢性增殖性皮炎或缺皮脂突變鼠等。各類模型均不能全面反映銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程，誘導動物模型能引起免疫調(diào)控因子變化，并促使炎性反應及損傷發(fā)生。IMQ是Toll樣受體激動劑，可通過刺激TLR7/8激活天然免疫并進一步激發(fā)適應性免疫。研究表明[7]，IMQ誘導的皮炎部分依賴于T細胞的存在，在IL-23或IL-17受體缺失的小鼠，疾病發(fā)展幾乎完全受阻，IL-23/IL-17軸在銀屑病樣皮炎發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用。

本實驗結果提示，Tc17細胞參與銀屑病樣皮膚炎癥過程，且Tc17與Th17細胞促進銀屑病發(fā)病的部分信號通路相似。本實驗初步分析了銀屑病樣小鼠血液中Tc17細胞比例及其表達相關細胞因子狀況，尚缺乏Tc17和Th17細胞相互關系的研究及Tc17細胞亞型的深入分類。在不同免疫病理狀態(tài)下，免疫細胞可分化為不同類型的亞群，Tc17細胞在特定極化條件下，還可向Tc1亞群轉(zhuǎn)化，深入研究 Tc17的功能和分化機制，可為進一步探索銀屑病的復雜機制提供新思路。