劉珊 劉鑫 林友剛
結(jié)腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤,積極探究結(jié)腸癌致病機(jī)制,是目前醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)[1]。GATA3及GATA6是GATA轉(zhuǎn)錄因子家族成員,可調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路,參與癌變的發(fā)生與發(fā)展。有研究表示,GATA3及GATA6表達(dá)水平與腸腺窩細(xì)胞增殖相關(guān),干擾GATA3/GATA6,能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞系致瘤能力,降低癌細(xì)胞增殖率[2]。GATA3/GATA6在結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展中可能也具備相似的作用。細(xì)胞自噬在癌變中的作用存在兩面性,其既可提高腫瘤對(duì)周邊環(huán)境的適應(yīng)性,也可誘導(dǎo)腫瘤凋亡[3]。本研究以結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞作為研究材料,利用干擾RNA轉(zhuǎn)染技術(shù),建立干擾GATA3/GATA6的細(xì)胞系,探究GATA3/GATA6在結(jié)腸癌發(fā)展中的價(jià)值。
人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購自北京腫瘤研究所。RPMI 1640培養(yǎng)液及胎牛血清均購自Cibco公司。RT-PCR試驗(yàn)所需的相關(guān)試劑盒購自Takara公司,mTOR、ULK1、LC3-B、β-actin引物序列由Takara公司合成。
1.干擾RNA轉(zhuǎn)染:結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞在6孔板中鋪板,每孔內(nèi)分別含有含5 μl小干擾序列以及l(fā)ipo3000 5 μl。分別在兩個(gè)含有125 μl完全培養(yǎng)液的離心管內(nèi)加入5 μl小干擾序列以及5 μl lipo3000,靜置5分鐘,吸取25 μl混合液于6孔板內(nèi),12小時(shí)后換液,48小時(shí)后提取細(xì)胞蛋白及總RNA。
2.細(xì)胞凋亡檢測:在對(duì)數(shù)生長期HCT116細(xì)胞內(nèi)加入0.25%蛋白酶消化細(xì)胞,制成密度為1×106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸浮液,取1 ml細(xì)胞懸浮液,1 000 rpm離心10分鐘后棄上清液,預(yù)冷PBS清洗。細(xì)胞重新懸浮并加入Annexin-V-FITC,室溫避光孵育20分鐘,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。
3.CCK-8檢測細(xì)胞增殖情況:轉(zhuǎn)染前1天,在96孔板中按5×103個(gè)細(xì)胞接種,每孔內(nèi)加入100 μl培養(yǎng)液,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔,共96孔板,分別于轉(zhuǎn)染0、24、48及72小時(shí)后,應(yīng)用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況。
4.實(shí)時(shí)定量PCR:總RNA快速提取試劑盒提取總RNA,miRNA特有的逆轉(zhuǎn)錄引物以及逆轉(zhuǎn)錄酶應(yīng)用于反向轉(zhuǎn)錄。RT-PCR反應(yīng)體系:5×PrimeScript Buffer 4 μl,1×PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μl;Oligo dT Primer(50 μm)1 μl(25 pmol);Random 6 mers(100 μm)1 μl(50 pmol);Total RNA 1 μl;RNase Free dH2O 12 μl。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 10分鐘,變性94 ℃ 30秒,退火/延伸60 ℃ 1分鐘,熔解曲線分析:95 ℃ 15秒,60 ℃ 1分鐘,94 ℃ 15秒,60 ℃ 15秒。引物序列見表1。RT-PCR結(jié)果由系統(tǒng)軟件自動(dòng)分析得出。
表1 引物序列
5.Western bolt法檢測各組蛋白表達(dá):抽取細(xì)胞總蛋白,BCA法檢測其濃度,加入5×SDS PAGE上樣緩沖液混合均勻,95 ℃恒溫反應(yīng)10分鐘,取40 μ蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離,蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,加入TBST封閉液,置于搖床上,37 ℃封閉1.5小時(shí),分別加入mTOR、ULK1、LC3-B以及β-actin抗體,4 ℃搖床過夜,TBST漂洗,加入辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗,37 ℃孵育1.5小時(shí),TBST洗膜后采用Band Scan軟件分析圖像,以β-actin抗體作為內(nèi)參,計(jì)算mTOR、ULK1、LC3-B蛋白相對(duì)表達(dá)量。
1.干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡水平:經(jīng)流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn),干擾GATA3/GATA6后,結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組(P<0.05),見表2。
表2 干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡水平
2.干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞增殖水平:干擾GATA3/GATA6后,結(jié)腸癌細(xì)胞存活率較空白對(duì)照組顯著下降(P<0.05),且隨時(shí)間推移呈依次下降趨勢(P<0.05),見表3。
表3 干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞增殖水平
3.干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)mTOR、ULK1、LC3-B mRNA表達(dá):干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)mTOR、ULK1、LC3-B mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05),見表4。
表4 干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)mTOR、ULK1、LC3-B mRNA表達(dá)
4.干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)mTOR、ULK1、LC3-B 蛋白表達(dá):干擾GATA3/GATA6后,結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)mTOR、ULK1、LC3-B蛋白表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05),見圖1。
圖1 干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)mTOR、ULK1、LC3-B蛋白表達(dá)
GATA6是結(jié)直腸癌細(xì)胞致瘤的主要調(diào)節(jié)因子。有研究指出,GATA6能調(diào)節(jié)LGR5表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)小鼠形成結(jié)腸腫瘤,且在結(jié)腸癌組織內(nèi),GATA6表達(dá)明顯上升,遠(yuǎn)高于結(jié)腸正常黏膜。GATA3調(diào)控著Th2的發(fā)育,在多種惡性腫瘤病人體內(nèi),Th2相關(guān)細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-6等表達(dá)均明顯增高。GATA3及GATA6與消化道相關(guān)臟器腫瘤,包括食道癌、胃癌、結(jié)腸癌等的生長密切相關(guān)[4]。
本研究將結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞納為研究材料,利用RNA干擾技術(shù),干擾HCT116細(xì)胞GATA3/GATA6后,顯示細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組明顯上升,且在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),其細(xì)胞增殖率明顯降低。提示干擾GATA3/GATA6可降低結(jié)腸癌細(xì)胞增殖率,提高細(xì)胞凋亡率,抑制腫瘤生長。
近年來,細(xì)胞自噬成為了腫瘤研究的新熱點(diǎn)。自噬是生物體內(nèi)普遍存在的一種現(xiàn)象,且與多種疾病的發(fā)生及發(fā)展間存在密切關(guān)聯(lián)。目前認(rèn)為,自噬與腫瘤之間的關(guān)系存在雙向性,其既能提高腫瘤適應(yīng)能力,促進(jìn)惡性細(xì)胞增殖,又可誘導(dǎo)腫瘤凋亡,發(fā)揮抑癌作用。從大體上來說,癌變的腫瘤自噬能力是下降的,這提示自噬能力降低是利于癌變的[5]。
目前,已發(fā)現(xiàn)30多種與自噬相關(guān)的基因,LC3-B是自噬的特異性標(biāo)志物,是其中最為關(guān)鍵的成員。mTOR以及ULK1也是自噬相關(guān)基因,ULK1是mTOR激酶的作用底物,mTOR被激活后ULK1被高度磷酸化,多種細(xì)胞因子可通過激活mTOR降低細(xì)胞自噬能力。本研究發(fā)現(xiàn),干擾GATA3/GATA6后,結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞自噬相關(guān)基因LC3-B、mTOR以及ULK1水平均明顯低于空白對(duì)照組,Western bolt法檢測發(fā)現(xiàn),干擾GATA3/GATA6后,結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞自噬相關(guān)基因LC3-B、mTOR以及ULK1的蛋白表達(dá)水平也明顯下降。自噬活性降低則可能激活細(xì)胞凋亡程序,進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抑癌作用。
綜上所述,干擾GATA3/GATA6可能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞自噬,抑制細(xì)胞增殖,增加細(xì)胞凋亡,發(fā)揮抑癌功效。