劉珊 劉鑫 林友剛

結(jié)腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤，積極探究結(jié)腸癌致病機(jī)制，是目前醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)[1]。GATA3及GATA6是GATA轉(zhuǎn)錄因子家族成員，可調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路，參與癌變的發(fā)生與發(fā)展。有研究表示，GATA3及GATA6表達(dá)水平與腸腺窩細(xì)胞增殖相關(guān)，干擾GATA3/GATA6，能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞系致瘤能力，降低癌細(xì)胞增殖率[2]。GATA3/GATA6在結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展中可能也具備相似的作用。細(xì)胞自噬在癌變中的作用存在兩面性，其既可提高腫瘤對(duì)周邊環(huán)境的適應(yīng)性，也可誘導(dǎo)腫瘤凋亡[3]。本研究以結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞作為研究材料，利用干擾RNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立干擾GATA3/GATA6的細(xì)胞系，探究GATA3/GATA6在結(jié)腸癌發(fā)展中的價(jià)值。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購(gòu)自北京腫瘤研究所。RPMI 1640培養(yǎng)液及胎牛血清均購(gòu)自Cibco公司。RT-PCR試驗(yàn)所需的相關(guān)試劑盒購(gòu)自Takara公司，mTOR、ULK1、LC3-B、β-actin引物序列由Takara公司合成。

二、方法

1.干擾RNA轉(zhuǎn)染：結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞在6孔板中鋪板，每孔內(nèi)分別含有含5 μl小干擾序列以及l(fā)ipo3000 5 μl。分別在兩個(gè)含有125 μl完全培養(yǎng)液的離心管內(nèi)加入5 μl小干擾序列以及5 μl lipo3000，靜置5分鐘，吸取25 μl混合液于6孔板內(nèi)，12小時(shí)后換液，48小時(shí)后提取細(xì)胞蛋白及總RNA。

2.細(xì)胞凋亡檢測(cè)：在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞內(nèi)加入0.25%蛋白酶消化細(xì)胞，制成密度為1×106個(gè)/ml的單細(xì)胞懸浮液，取1 ml細(xì)胞懸浮液，1 000 rpm離心10分鐘后棄上清液，預(yù)冷PBS清洗。細(xì)胞重新懸浮并加入Annexin-V-FITC，室溫避光孵育20分鐘，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

3.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：轉(zhuǎn)染前1天，在96孔板中按5×103個(gè)細(xì)胞接種，每孔內(nèi)加入100 μl培養(yǎng)液，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，共96孔板，分別于轉(zhuǎn)染0、24、48及72小時(shí)后，應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

4.實(shí)時(shí)定量PCR：總RNA快速提取試劑盒提取總RNA，miRNA特有的逆轉(zhuǎn)錄引物以及逆轉(zhuǎn)錄酶應(yīng)用于反向轉(zhuǎn)錄。RT-PCR反應(yīng)體系：5×PrimeScript Buffer 4 μl，1×PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μl；Oligo dT Primer(50 μm)1 μl(25 pmol)；Random 6 mers(100 μm)1 μl(50 pmol)；Total RNA 1 μl；RNase Free dH2O 12 μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10分鐘，變性94 ℃ 30秒，退火/延伸60 ℃ 1分鐘，熔解曲線分析：95 ℃ 15秒，60 ℃ 1分鐘，94 ℃ 15秒，60 ℃ 15秒。引物序列見表1。RT-PCR結(jié)果由系統(tǒng)軟件自動(dòng)分析得出。

表1 引物序列

5.Western bolt法檢測(cè)各組蛋白表達(dá)：抽取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)其濃度，加入5×SDS PAGE上樣緩沖液混合均勻，95 ℃恒溫反應(yīng)10分鐘，取40 μ蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，加入TBST封閉液，置于搖床上，37 ℃封閉1.5小時(shí)，分別加入mTOR、ULK1、LC3-B以及β-actin抗體，4 ℃搖床過(guò)夜，TBST漂洗，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育1.5小時(shí)，TBST洗膜后采用Band Scan軟件分析圖像，以β-actin抗體作為內(nèi)參，計(jì)算mTOR、ULK1、LC3-B蛋白相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

1.干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡水平：經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，干擾GATA3/GATA6后，結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

表2 干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡水平

2.干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞增殖水平：干擾GATA3/GATA6后，結(jié)腸癌細(xì)胞存活率較空白對(duì)照組顯著下降(P<0.05)，且隨時(shí)間推移呈依次下降趨勢(shì)(P<0.05)，見表3。

表3 干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞增殖水平

3.干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)mTOR、ULK1、LC3-B mRNA表達(dá)：干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)mTOR、ULK1、LC3-B mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P<0.05)，見表4。

表4 干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)mTOR、ULK1、LC3-B mRNA表達(dá)

4.干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)mTOR、ULK1、LC3-B 蛋白表達(dá)：干擾GATA3/GATA6后，結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)mTOR、ULK1、LC3-B蛋白表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，見圖1。

圖1 干擾GATA3/GATA6后結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)mTOR、ULK1、LC3-B蛋白表達(dá)

討論

GATA6是結(jié)直腸癌細(xì)胞致瘤的主要調(diào)節(jié)因子。有研究指出，GATA6能調(diào)節(jié)LGR5表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)小鼠形成結(jié)腸腫瘤，且在結(jié)腸癌組織內(nèi)，GATA6表達(dá)明顯上升，遠(yuǎn)高于結(jié)腸正常黏膜。GATA3調(diào)控著Th2的發(fā)育，在多種惡性腫瘤病人體內(nèi)，Th2相關(guān)細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-6等表達(dá)均明顯增高。GATA3及GATA6與消化道相關(guān)臟器腫瘤，包括食道癌、胃癌、結(jié)腸癌等的生長(zhǎng)密切相關(guān)[4]。

本研究將結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞納為研究材料，利用RNA干擾技術(shù)，干擾HCT116細(xì)胞GATA3/GATA6后，顯示細(xì)胞凋亡率較空白對(duì)照組明顯上升，且在培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，其細(xì)胞增殖率明顯降低。提示干擾GATA3/GATA6可降低結(jié)腸癌細(xì)胞增殖率，提高細(xì)胞凋亡率，抑制腫瘤生長(zhǎng)。

近年來(lái)，細(xì)胞自噬成為了腫瘤研究的新熱點(diǎn)。自噬是生物體內(nèi)普遍存在的一種現(xiàn)象，且與多種疾病的發(fā)生及發(fā)展間存在密切關(guān)聯(lián)。目前認(rèn)為，自噬與腫瘤之間的關(guān)系存在雙向性，其既能提高腫瘤適應(yīng)能力，促進(jìn)惡性細(xì)胞增殖，又可誘導(dǎo)腫瘤凋亡，發(fā)揮抑癌作用。從大體上來(lái)說(shuō)，癌變的腫瘤自噬能力是下降的，這提示自噬能力降低是利于癌變的[5]。

目前，已發(fā)現(xiàn)30多種與自噬相關(guān)的基因，LC3-B是自噬的特異性標(biāo)志物，是其中最為關(guān)鍵的成員。mTOR以及ULK1也是自噬相關(guān)基因，ULK1是mTOR激酶的作用底物，mTOR被激活后ULK1被高度磷酸化，多種細(xì)胞因子可通過(guò)激活mTOR降低細(xì)胞自噬能力。本研究發(fā)現(xiàn)，干擾GATA3/GATA6后，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞自噬相關(guān)基因LC3-B、mTOR以及ULK1水平均明顯低于空白對(duì)照組，Western bolt法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，干擾GATA3/GATA6后，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞自噬相關(guān)基因LC3-B、mTOR以及ULK1的蛋白表達(dá)水平也明顯下降。自噬活性降低則可能激活細(xì)胞凋亡程序，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，干擾GATA3/GATA6可能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌功效。