李光澤 張濟(jì) 林昌儉 俞慎林 包平倩

腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)定義為腹主動(dòng)脈局部擴(kuò)張超過(guò)正常直徑的1.5倍，是一種老年人群的慢性退行性疾病，與炎性反應(yīng)密切相關(guān)[1]。AAA早期無(wú)明顯癥狀，早期診斷指標(biāo)有限，在發(fā)現(xiàn)時(shí)病人出現(xiàn)破裂和血栓的風(fēng)險(xiǎn)大大提高[2]。Notch通路是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控細(xì)胞免疫和炎性反應(yīng)的關(guān)鍵通路，Notch被激活后可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞中泌白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6以及凋亡蛋白的分泌，從而引起血管重塑[3]。T細(xì)胞激活分泌調(diào)節(jié)因子(reduced upon activation mormal T expression and secreted，RANTES)是一種由血管細(xì)胞分泌的趨化因子配體，具有促進(jìn)炎癥影響血管結(jié)構(gòu)和功能的作用，參與血壓引起血管病變以及動(dòng)脈粥樣硬化等[4]。本文分析Notch1和RANTES在AAA病人血清和組織中的表達(dá)及其意義。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2019年1月～2021年1月于我院接受手術(shù)治療的AAA病人41例作為AAA組，年齡45～80歲，平均年齡(59.4±4.4)歲，男23例，女17例，吸煙史15例，高血壓18例，糖尿病8例。所有病人均保存外周血液標(biāo)本，在手術(shù)過(guò)程中收集AAA組織和AAA旁距病灶3 cm以上的正常腹主動(dòng)脈組織。同時(shí)選擇在我院進(jìn)行體檢的健康志愿者41例作為健康組，年齡44～78歲，平均(58.7±4.5)歲，男22例，女18例，吸煙11例，高血壓12例，糖尿病5例。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡45～80歲；CT血管造影符合AAA的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；首次發(fā)??；病人均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并全身性感染；合并精神異常、意識(shí)障礙；合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病、血液學(xué)疾??；資料不全。

二、方法

1.RT-qPCR檢測(cè)：提取外周血中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，條件：37 ℃/15分鐘；98 ℃/5分鐘。使用BestarTMqPCR試劑盒(DBI Bioscience公司，德國(guó))進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，條件如下：95 ℃ 2分鐘， 94 ℃ 20秒，58 ℃ 20秒，72 ℃ 20秒，40個(gè)循環(huán)，72 ℃下延伸4分鐘。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行RT-qPCR分析。通過(guò)比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算Notch1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。Notch1上游引物：5'-TCAGCGGGATCCACTGTGAG-3'，下游引物：5'-ACACAGGCAGGTGAACGAGTTG-3'，GAPDH上游引物：5'-TGAGGCTGGAAGTGGAAG-3'，下游引物：5'-CTTTAGGGTAGTGGTAGAAG-3' 。

2.ELISA檢測(cè)：外周血離心(2 000 rpm，20分鐘)收集血清。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)加入抗體和顯色劑進(jìn)行反應(yīng)，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算RANTES的濃度。

3.Western blot檢測(cè)：組織裂解后4 ℃，12 000 rpm離心5分鐘，收集總蛋白。8% SDS-PAGE分離樣品中等量(50 μg)的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2小時(shí)封閉非特異性抗原。將膜分別與anti-Notch1和anti-RANTES在4 ℃下孵育過(guò)夜，將膜與相應(yīng)的二抗室溫下孵育1小時(shí)。使用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，使用Quantum One軟件分析灰度計(jì)算蛋白相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1.血清中Notch1 mRNA和RANTES水平比較： AAA病人血清中Notch1 mRNA和RANTES水平均高于健康組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 血清中Notch1 mRNA和RANTES水平比較

2.Notch1和RANTES蛋白在AAA組織中的表達(dá)：AAA組織中的Notch1和RANTES蛋白表達(dá)水平高于正常的腹主動(dòng)脈組織，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表2。

圖1 Western blot檢測(cè)AAA組織和主動(dòng)脈組織中Notch1和RANTES蛋白表達(dá)水平

表2 AAA組織和主動(dòng)脈組織中Notch1和RANTES蛋白相對(duì)表達(dá)水平

3.Notch1和RANTES在血清和組織中的相關(guān)性：AAA病人組織Notch1蛋白水平和血清Notch1 mRNA水平正相關(guān)(r=0.485,P=0.025)；組織中RANTES蛋白水平與血清RANTES濃度正相關(guān)(r=0.506,P=0.016)。見(jiàn)圖2。

圖2 Notch1和RANTES在血清和組織中的相關(guān)性

4.AAA中Notch1與RANTES的相關(guān)性：在AAA病人組織和血清中，Notch1和RANTES表達(dá)均呈正相關(guān)(r血清=0.515,P=0.014；r組織=0.537,P=0.008)。見(jiàn)圖3。

圖3 AAA中Notch1與RANTES的相關(guān)性

討論

目前，治療AAA的方法仍主要為對(duì)癥治療。有研究表明，炎性反應(yīng)參與AAA的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程，且免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)和血管凋亡促進(jìn)AAA疾病進(jìn)展[6]。

Notch通路是誘導(dǎo)促炎基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵通路，在炎性進(jìn)程中，Notch1蛋白過(guò)表達(dá)，其剪切下的NICD片段會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的激活，促進(jìn)IL-6和TNF-α等的表達(dá)和分泌[7]。RANTES也稱為CC趨化因子配體5(CCL5)，是炎癥細(xì)胞的重要化學(xué)引物，與動(dòng)脈的粥樣硬化發(fā)病機(jī)制有關(guān)[8]。RANTES可以由血管細(xì)胞和脂肪組織的常駐細(xì)胞產(chǎn)生，體外添加的血管緊張素Ⅱ會(huì)增加RANTES在小動(dòng)脈和小靜脈內(nèi)皮中的表達(dá)，而RANTES在血管周?chē)装Y的發(fā)生中起關(guān)鍵作用，并引起高血壓相關(guān)的血管功能障礙[9]。本次研究主要分析Notch通路和RANTES是否參與了AAA的發(fā)生和發(fā)展，結(jié)果表明AAA病人血清中Notch1 mRNA和RANTES的水平顯著高于健康者，且AAA組織中的Notch1和RANTES蛋白水平也顯著高于正常AAA組織。此外，AAA組織中的Notch1和RANTES水平與血清正相關(guān)。本次研究結(jié)果初步表明，Notch1和RANTES的過(guò)表達(dá)可能參與了AAA的發(fā)生或發(fā)展，并且組織中的Notch1和RANTES水平可反應(yīng)在血清中，提示檢測(cè)血清中Notch1和RANTES的水平可能是早期輔助診斷AAA的可行的指標(biāo)。但是關(guān)于Notch1和RANTES在AAA中的臨床意義仍需要擴(kuò)大樣本分析。

T淋巴細(xì)胞和組織中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞也參與AAA的發(fā)生和發(fā)展，它們會(huì)響應(yīng)各種環(huán)境因素而發(fā)生表型變化，從而分泌細(xì)胞因子導(dǎo)致血管重塑[10-11]。Notch通路不但會(huì)促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌炎性因子，還會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1表型轉(zhuǎn)化，M1表型巨噬細(xì)胞會(huì)分泌IL-6和TNF-α等引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凋亡[12]。而Notch通路也會(huì)促進(jìn)免疫細(xì)胞中RANTES的表達(dá)，從而進(jìn)一步激活炎性反應(yīng)[13]。本研究中，AAA病人血清和組織中Notch1和RANTES均呈現(xiàn)正相關(guān)，初步說(shuō)明了Notch1和RANTES存在共同促炎的作用。文獻(xiàn)報(bào)道提示，Notch1可能通過(guò)促進(jìn)RANTES的表達(dá)促進(jìn)炎性反應(yīng)，進(jìn)而參與AAA[14]。然而，Notch1促進(jìn)RANTES表達(dá)的機(jī)制仍需要進(jìn)一步的細(xì)胞定位的方法驗(yàn)證Notch1與RANTES表達(dá)在AAA組織中的何種細(xì)胞，從而進(jìn)一步分析Notch1和RANTES參與AAA的機(jī)理。

綜上所述，AAA病人血清和組織中的Notch1和RANTES均過(guò)表達(dá)，且二者正相關(guān)。檢測(cè)血清Notch1 mRNA和RANTES水平對(duì)AAA早期診斷具有重要意義。