夏 慧 葉 尚 劉福林 王寶峰,4

1深圳出入境邊防檢查總站醫(yī)院 廣東 深圳 518013；2深圳市南山區(qū)蛇口人民醫(yī)院 廣東 深圳 518067；3法國(guó)國(guó)家健康與醫(yī)學(xué)研究院附屬于巴黎大學(xué) 法國(guó) 巴黎 75006；4鄂爾多斯婦產(chǎn)醫(yī)院婦產(chǎn)科 內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000

先兆子癇（pre-eclampsia，PE）往往伴隨于妊娠期高血壓而發(fā)生，是妊娠期高血壓疾病的常見(jiàn)并發(fā)癥，其全球范圍內(nèi)的發(fā)病率約為2%～8%，而其所致的孕產(chǎn)婦死亡率占比高達(dá)14%［1，2］。研究表明胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞在母體子宮內(nèi)膜的異常植入可導(dǎo)致子宮螺旋動(dòng)脈的重建異常而導(dǎo)致母體與胎兒血液在進(jìn)入胎盤(pán)內(nèi)流動(dòng)時(shí)發(fā)生不暢而引起母體血壓增高，從而導(dǎo)致PE的發(fā)生［3］。同樣地，胎盤(pán)發(fā)育異常也可胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩（intrauterine growth restriction，IUGR），其與PE同屬于嚴(yán)重妊娠疾病，表現(xiàn)為胎盤(pán)因素等所致的胎兒在宮內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育受限，導(dǎo)致胎兒的健康及生命遭受?chē)?yán)重威脅［4，5］。然 而，無(wú)論是PE還是IUGR，盡管已有大量研究，但其具體發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚。

本研究利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）分析了由Awamleh等［6］上傳的關(guān)于正常胎盤(pán)、PE胎盤(pán)、IUGR胎盤(pán)及PE+IUGR胎盤(pán)組織的基因測(cè)序數(shù)據(jù)集，從更宏觀(guān)的角度探討了在PE及IUGR發(fā)生中起重要作用的基因集，并且本研究還系統(tǒng)比較了主要富集通路在兩種疾病中所起的作用及其差別。本研究所運(yùn)用的WGCNA方法已證實(shí)廣泛運(yùn)用于分析高通量數(shù)據(jù)集，在尋找基因間的關(guān)聯(lián)性及構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)上具有重要作用［7］。通過(guò)新方法的運(yùn)用，本研究旨在為PE及IUGR的研究提供更廣闊的思路。

1 資料與方法

1.1 高通量數(shù)據(jù)集的收集進(jìn)入NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/），并下載GSE114691。GSE114691由Awamleh等［6］上傳，其來(lái)源于患有或不患有PE及IUGR的患者，包括21個(gè)無(wú)疾病對(duì)照組胎盤(pán)組織，20個(gè)PE胎盤(pán)組織，18個(gè)IUGR胎盤(pán)組織以及20個(gè)PE及IUGR混合并發(fā)癥的胎盤(pán)組織。從組織內(nèi)分離RNA后由Illumina HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 WGCNA分析運(yùn)用R軟件（version 3.60）中的Affy包（version 1.64）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，包括讀取原始數(shù)據(jù)，歸一化矯正，去除包含缺失值的行。構(gòu)建以患有或不患有PE及IUGR的表型文件。將所有不包含缺失值的行納入WGCNA分析，本研究中共納入12 084個(gè)基因。運(yùn)用WGCNA包（version 1.67）對(duì)樣本進(jìn)行聚類(lèi)以剔除離群樣本，篩選軟閾值進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，將鄰接矩陣轉(zhuǎn)換為拓?fù)渲丿B矩陣用于篩選相關(guān)模塊并以不同顏色表示，構(gòu)建基因與性狀散點(diǎn)圖并繪制相關(guān)性熱圖。

1.3 關(guān)鍵基因的富集分析及比較提取相關(guān)系數(shù)（r）大于0.4以上的彩色模塊中的基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)通路（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析。分析的可視化由R包c(diǎn)lusterProfiler（version 3.14）執(zhí)行并且以P＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。最后，比較對(duì)照組、PE組、IUGR組、PE&IUGR組基因富集分析的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 樣本聚類(lèi)及性狀匹配下載原始數(shù)據(jù)，并用Affy包進(jìn)行原始數(shù)據(jù)整理。通過(guò)排除缺失值以滿(mǎn)足WGCNA算法分析模式。最后納入12 084個(gè)基因用于后續(xù)分析。對(duì)不同組別的樣本表達(dá)矩陣進(jìn)行組合，構(gòu)建WGCNA分析所需要的矩陣形式，同時(shí)構(gòu)建樣本表型文件。對(duì)對(duì)照組、PE組、IUGR組及PE&IUGR組的樣本進(jìn)行K-means方式聚類(lèi)，同時(shí)對(duì)樣本所屬性狀進(jìn)行了匹配。結(jié)果顯示IUGR5樣本明顯偏離群體，故予以剔除后再進(jìn)行分析。

2.2 軟閾值篩選及共表達(dá)模塊構(gòu)建以及模塊與基因相關(guān)性熱圖運(yùn)用WGCNA計(jì)算共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性首先需要確定用于分析的軟閾值，本研究設(shè)定1～30范圍進(jìn)行分析，當(dāng)r2大于0.9時(shí)則選取用于后續(xù)分析。本例中選取的軟閾值為22。同樣的，本研究成功獲取多種顏色共表達(dá)模塊，并且對(duì)模塊進(jìn)行了合并處理以剔除只包含少量基因的共表達(dá)模塊。最后，本研究通過(guò)熱圖呈現(xiàn)了基因與模塊間的相關(guān)系數(shù)，其中較相關(guān)區(qū)域（淺黃色）提示了關(guān)鍵模塊與基因的存在（圖1）。

圖1 共表達(dá)模塊構(gòu)建及合并后模塊中基因的相關(guān)系數(shù)熱圖

2.3 共表達(dá)模塊篩選與基因性狀系數(shù)散點(diǎn)圖運(yùn)用WGCNA分析性狀表型與不同模塊之間的關(guān)系，可得到如下所示的相關(guān)系數(shù)熱圖（圖2A）。結(jié)果顯示多數(shù)模塊與正常對(duì)照組相關(guān)，少數(shù)模塊與其它疾病組具有相對(duì)較低的相關(guān)性。接著提取不同模塊中的基因與性狀的相關(guān)系數(shù)作散點(diǎn)圖，下圖只展示部分代表性模塊。結(jié)果顯示，在PE組藍(lán)色模塊中，有323個(gè)基因與此性狀具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)較高（r=0.42，P＜0.05）；在IUGR組灰色模塊中，318個(gè)基因與性狀具有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)較高（r=0.4，P＜0.05）。本研究保留PE組（圖2B）及IUGR組（圖2C）有意義模塊中的基因進(jìn)行后續(xù)分析及比較。

圖2 共表達(dá)模塊與性狀相關(guān)系數(shù)熱圖及基因性狀相關(guān)系數(shù)散點(diǎn)圖

2.4 PE及IUGR組關(guān)鍵模塊中基因富集分析及比較納入PE組及IUGR組關(guān)鍵模塊中基因用于富集分析。本研究采納了GO分析中的生物過(guò)程（biological process，BP）分析，以及KEGG的信號(hào)通路（Pathway）分析，展示了富集程度最顯著的15個(gè)詞條。結(jié)果顯示，PE組中GO_BP分析提示了蛋白合成及折疊、DNA轉(zhuǎn)錄、DNA損傷調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期等的異常（圖3A），同時(shí)KEGG信號(hào)通路提示了RNA降解、剪接體、脂質(zhì)代謝及激素合成等方面的異常（圖3B）。IUGR組中GO_BP分析提示了甾體類(lèi)激素合成、細(xì)胞黏附、免疫反應(yīng)等方面的異常（圖3C），同時(shí)KEGG信號(hào)通路提示了補(bǔ)體反應(yīng)、氨基酸代謝、糖代謝、磷酸化反應(yīng)、p53信號(hào)通路等方面的異常（圖3D）。同時(shí)本研究比較了PE組及IUGR組富集詞條，結(jié)果顯示，GO_BP分析在兩組中具有較大差異，無(wú)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的詞條重復(fù)（圖3E）；而KEGG通路提示除甲狀旁腺激素代謝及壽命調(diào)節(jié)通路的重疊外，無(wú)其它具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的詞條重復(fù)（圖3F）。這些結(jié)果反映了本研究篩選基因及其對(duì)應(yīng)通路的特異性。

圖3 PE組及IUGR組關(guān)鍵基因的富集分析及比較

3 討論

PE及IUGR在致孕產(chǎn)婦及胎兒死亡方面具有高危性，而其相關(guān)基因及其通路的研究仍不明了，既往關(guān)于PE及IUGR的研究，以本例所下載數(shù)據(jù)集的相關(guān)文獻(xiàn)為例，一般采用優(yōu)化t檢驗(yàn)檢測(cè)不同組別之間的基因表達(dá)并篩選出最具表達(dá)差異的基因集，隨后對(duì)這些數(shù)據(jù)集進(jìn)行富集分析。然而，單純的差異基因表達(dá)檢測(cè)忽略了基因表達(dá)在生物體內(nèi)的相關(guān)性，割裂了基因表達(dá)的整體性，片面地富集最高差異表達(dá)的基因會(huì)喪失更全面的通路信息，而WGCNA通過(guò)計(jì)算相關(guān)性則尤其適用于分析具有n×m矩陣形式的臨床樣本微列陣數(shù)據(jù)［7］。

WGCNA包被廣泛用于構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)狀，分析基因與性狀之間的關(guān)系，探索有意義的表達(dá)模塊，計(jì)算相關(guān)性，可視化等，其近年來(lái)尤其用于探索腫瘤基因表達(dá)與臨床表征之間的關(guān)系，然而WGCNA鮮少用于探索研究人母胎臨床表征及疾病之間的關(guān)系。既往文獻(xiàn)僅涉及運(yùn)用WGCNA探索全基因組表達(dá)與母體體重指數(shù)及胎兒生長(zhǎng)之間的關(guān)系，以及用于發(fā)現(xiàn)與妊娠期糖尿病相關(guān)的潛在生物學(xué)標(biāo)志物［8-10］。目前尚無(wú)研究運(yùn)用WGCNA探索PE及IUGR的特異基因及相關(guān)通路。因此，本研究旨在通過(guò)WGCNA法分析PE及IUGR的特異基因及相關(guān)通路。值得注意的是，雖然本研究并無(wú)一般研究中的臨床特征指標(biāo)（如年齡、體質(zhì)量等），但本研究創(chuàng)意性地將正常、PE、IUGR、PE&IUGR作為了樣本的臨床表型進(jìn)行相關(guān)性分析。

本研究剔除了IUGR第5個(gè)樣本，因聚類(lèi)分析結(jié)果顯示其為離群值，從樣本聚類(lèi)結(jié)果來(lái)看，樣本聚類(lèi)結(jié)果較為緊密，適用于后續(xù)分析。后續(xù)分析結(jié)果提示大量基因與正常對(duì)照組相關(guān)，而少量與PE或IUGR有關(guān)。鑒于導(dǎo)致疾病發(fā)生的基因或參與通路可能占總體基因的比例較小，大部分的基因整體表達(dá)趨于正常，此結(jié)果則可能是合理的。而PE&IUG聯(lián)合組未能檢測(cè)到大量較高相關(guān)性的基因則可能歸因于其各自特異性的基因及通路較少重合，從而形成數(shù)據(jù)噪音，影響了對(duì)潛在有效基因的檢測(cè)，降低了基因與該性狀的相關(guān)程度。本研究的富集分析結(jié)果提示，PE與細(xì)胞生命周期有關(guān)，這與既往關(guān)于胎盤(pán)細(xì)胞衰老在胎盤(pán)中作用的研究［11］一致；同時(shí)PE發(fā)生伴隨的DNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程及蛋白質(zhì)合成及代謝異常也見(jiàn)諸于既往的報(bào)道［12］之中。IUGR的發(fā)生及參與的甾體類(lèi)激素合成、氨基酸代謝、p53信號(hào)通路等同樣在既往研究［13-15］中有報(bào)道。故而說(shuō)明本研究中可能存在尚未經(jīng)其他研究提及的有用通路，而這些通路可能具有進(jìn)一步的研究?jī)r(jià)值。此外，本研究還通過(guò)基因與通路的熱圖展示了參與相關(guān)通路的相應(yīng)基因群。例如在IUGR組中，熱 圖 顯 示CFLAR、CRY 2、FBXO32、FOXO1、FOXO3、KLF9參與了細(xì)胞受糖皮質(zhì)激素刺激的反應(yīng)過(guò)程，這既與之前的系列研究［13，16］所得的糖皮質(zhì)激素參與IUGR發(fā)生的結(jié)論一致，又彌補(bǔ)了既往研究在探究其中具體基因方面的缺陷。

因此，本研究通過(guò)新方法WGCNA的運(yùn)用，分析了PE及IUGR組臨床樣本的微列陣數(shù)據(jù)，揭示了PE及IUGR的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所涉及到的各自特異性的參與基因及相應(yīng)信號(hào)通路，為進(jìn)一步研究PE及IUGR的胎盤(pán)發(fā)生機(jī)制提供了新思路。