袁喜安 戴 旋 鄒 苗 郭玉琳 王超男 顏 彬 吳緒峰 馬全富

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬湖北婦幼保健院腫瘤婦科 湖北 武漢 430070

異位妊娠（ectopic pregnancy，EP）是婦產(chǎn)科常見的急腹癥之一，近年來發(fā)病率有明顯升高的趨勢，目前占所有妊娠的1%～2%［1］，嚴重影響育齡期女性的生育能力和生命安全。因此，EP的早期診治對其具有重要的臨床意義［2］。目前臨床上常用的診斷方法是人絨毛膜促性腺激素（HCG）聯(lián)合超聲檢查，但早期異位妊娠臨床表現(xiàn)不典型，診斷較困難，40%～50%的異位妊娠患者在急診初診中被誤診［3］。早期診斷異位妊娠的方法除陰道超聲檢查、診斷性刮宮、腹腔鏡探查等外，檢測患者的血清標志物也是常用的預測方法。本研究旨在對早期正常宮內(nèi)妊娠者和確診EP患者的血清血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、促血管生成素（angiopoietin，Ang）-1和Ang-2濃度進行檢測，探討其在EP診斷中的價值，從而為臨床提供更為簡便易行、安全可靠的早期診斷方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2016—2018年在華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬湖北婦幼保健院婦科診斷為異位妊娠的患者53例，依據(jù)病史、體格檢查，結合B超檢查確診；正常妊娠組來自門診同期就診共50例。兩組在年齡、孕產(chǎn)史、體質量指數(shù)、停經(jīng)時間方面的差異無統(tǒng)計學意義。所有對象均排除其他引起VEGF、Ang-1、Ang-2值升高的相關疾病。該實驗獲得了醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會同意，所有研究對象實驗前進行了充分告知并簽字同意。

1.2 方法兩組均未經(jīng)任何治療，就診時采集空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min，取血清置于-80℃冰箱待檢。應用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法測定血清中VEGF、Ang-1和Ang-2的含量，試劑盒購自欣博盛生物公司QuantiCyto?Human VEGF ELISA kit（Lot#：H160617-108a）和美國Ray-Bio公司的Ray Bio?Human ANGPT 1 ELISA Kit（Lot#：0617160102）、RayBio?Human ANGPT 2 ELISA Kit（Lot#：0617160224）。ELISA操 作 參照試劑盒說明書，每一樣本設置3個復孔，使用酶標儀（芬蘭雷勃公司）檢測光密度（OD）值，檢測波長為450 nm。利用標準曲線法計算未知樣品的濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，定量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間差異性的統(tǒng)計推斷采用t檢驗；非正態(tài)分布以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，組間差異性統(tǒng)計推斷采用非參數(shù)秩和檢驗。各指標診斷效力/價值的評價采用受試者工作特征(ROC）曲線分析，指標聯(lián)合診斷的疾病預測模型及預測概率值計算采用二元Logistic回歸。ROC曲線分析及差異的統(tǒng)計檢驗采用Med Calc 19.1軟件。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 異位妊娠組母體外周血中血清VEGF、Ang-1、Ang-2濃度與早期宮內(nèi)妊娠組比較異位妊娠組母體外周血中血清VEGF濃度中位數(shù)234.6 pg/mL，明顯高于早期宮內(nèi)妊娠組（77.3 pg/mL），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而HCG（2 096.0 U/L）和Ang-2（11.8 ng/mL）的血清水平對比正常早孕組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Ang-1在兩組間的血清濃度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1，異位妊娠組和正常宮內(nèi)早孕組VEGF、Ang-1、Ang-2三指標的血清濃度值散點圖分析見圖1。

圖1 異位妊娠和正常早孕組VEGF、Ang-1、Ang-2母體外周血清濃度散點圖***P＜0.05

表1 異位妊娠與正常早孕組相關指標的比較

2.2 ROC曲線分析以評價VEGF和Ang-2診斷異位妊娠的效力鑒于VEGF和Ang-2在兩組間的血清濃度比較有統(tǒng)計學意義，故將其納入ROC曲線分析以評價其診斷異位妊娠的效力。通過ROC曲線分析得出，以VEGF單一指標診斷異位妊娠的最佳血清濃度截斷值（cut-off值）為196.931 pg/mL（圖2），靈敏度為77.4%，特異度為92.0%，ROC曲線下面積（AUC）為0.889（P＜0.001），陽性預測值（PPV）為89.1%，陰性預測值（NPV）為78.9%。以Ang-2單一指標診斷異位妊娠的最佳血清濃度截斷值 為14.075 ng/mL（圖2），AUC為0.854（P＜0.001）。靈敏度、特異度、PPV、NPV分別為79.2%、80.0%、80.8%、78.4%。VEGF和Ang-2聯(lián)合診斷異位妊娠時ROC的AUC為0.916（P＜0.001），靈敏度、特異度、PPV、NPV分別為81.1%、92.0%、91.5%、82.1%。VEGF+Ang-2聯(lián)合診斷的AUC、靈敏度、特異度、PPV和NPV都較VEGF或Ang-2單獨診斷時高（見表2），但經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，聯(lián)合診斷的AUC值與VEGF或Ang-2單獨診斷時的AUC值差異并無統(tǒng)計學意義（VEGFvs聯(lián)合：P=0.146；Ang-2vs聯(lián)合：P=0.052）。見圖2。

表2 VEGF、Ang-2單獨和聯(lián)合診斷早期異位妊娠的價值（ROC曲線參數(shù)）

圖2 VEGF、Ang-2單獨和聯(lián)合診斷EP的ROC曲線

3 討論

目前的數(shù)據(jù)表明，妊娠6～9周的單胎孕婦的稽留流產(chǎn)率約為2%，其發(fā)病因素復雜，涉及胚胎染色體異常、內(nèi)分泌異常、細胞凋亡異常、子宮胎盤循環(huán)障礙、環(huán)境因素等多方面。妊娠過程中，從受精卵著床到胎盤形成的每個階段都與新生血管的生成和豐富的血液供應有著密切的關系。參與血管生成調(diào)節(jié)的因子眾多，其中血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素等在調(diào)節(jié)血管生成中發(fā)揮著重要作用［4，5］。本研究在中國人群中證實了血清VEGF、Ang-1和Ang-2是可以作為預測異位妊娠的潛在生物標志。

成功的妊娠從胚胎著床到胎盤形成過程離不開血管的重塑，即血管新生及其通透性的改變，在眾多血管生成因子的參與下，滋養(yǎng)細胞進入母體子宮，侵入子宮螺旋小動脈，建立母體與胎兒之間的血管網(wǎng)，從而實現(xiàn)其營養(yǎng)交換［6］。這一過程中，VEGF-VEGFR、Ang-Tie-2在調(diào)節(jié)血管生成中發(fā)揮著尤為重要的作用，如果這一變化未能按時、充分發(fā)生，則會影響胚胎的正常發(fā)育，甚至出現(xiàn)流產(chǎn)。

Ang-1可維持胎盤血管的生長，Ang-2為Ang-1的天然競爭拮抗劑，減小血管的穩(wěn)定性，促進血管重塑，兩者共同作用對胎盤有保護作用［7］。Ang-2對血管生成的影響與VEGF有關，Ang-2單獨存在時，可抑制新生血管的形成，并促進成熟血管退化；而與VEGF同時存在時，則可使血管保持在可塑狀態(tài)，促使內(nèi)皮細胞出芽以形成新的血管分支，促進血管生成和血管重建［8］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)異位妊娠組血HCG（2 096.0 U/L）較正常妊娠組低（6 563.0 U/L），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Ang-2（11.8 ng/mL）的血清水平對比正常早孕組（16.8 ng/mL）明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但Ang-1在兩組間的血清濃度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。說明Ang-2可作為異位妊娠診斷的一個輔助性標志物。

VEGF有多種功能，而其最主要的作用發(fā)生在血管內(nèi)皮細胞，高濃度的VEGF與許多生殖過程有關：如卵泡的生長過程、子宮內(nèi)膜的增生過程已及早孕期妊娠黃體的維持和囊胚著床過程等。在缺氧的條件下VEGF的表達增加，異位妊娠中VEGF的產(chǎn)生和分泌似乎會增高，有研究發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層對管壁的浸潤程度越高，VEGF的水平越高［6］。VEGF可作為宮外孕的診斷標志之一。我們研究發(fā)現(xiàn)異位妊娠組血VEGF（234.6 pg/mL），明顯高于正常妊娠組（77.3 pg/mL），這一結果與VEGF的作用機制相符。

Felemban等［9］將研究對象分為宮內(nèi)正常妊娠組、胚胎停育組與輸卵管妊娠組，比較3組VEGF水平后得出結論，把VEGF水平為200 pg/mL作為鑒別異位妊娠與正常宮內(nèi)孕的截斷值，其靈敏度為88%，特異度為100%。我們的研究中將VEGF的Cut-off值設為大于196.931 pg/mL，診斷為宮外孕的靈敏度為77.4%，特異度為92.0%。結論同F(xiàn)elemban等［9］的報道基本一致。Ang-2的單獨Cutoff值設為小于14.075 pg/mL，診斷異位妊娠的敏感性和特異性分別是79.2%和80.0%。而兩者聯(lián)合檢測的AUC、靈敏度、特異度、PPV和NPV分別為0.916、81.1%、92.0%、91.5%、82.1%，都 較VEGF或Ang-2單獨診斷時高，但經(jīng)統(tǒng)計學檢驗比較，聯(lián)合診斷的AUC值與VEGF或Ang-2單獨診斷時的AUC值差異并無統(tǒng)計學意義，未能提高檢測效率。我們的研究在中國人群中證實了血清VEGF和Ang-2是可以作為預測異位妊娠的潛在生物標志物，對超聲及HCG診斷不明的異位妊娠可以起到輔助診斷的作用。