楊 燕 賀 鑫 龔鵬舉 宋文靜 魏 蕾 張京偉

1武漢大學(xué)中南醫(yī)院甲狀腺乳腺外科 湖北 武漢 430071；2武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理與病理生理學(xué)教研室 湖北 武漢 430071

乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，也是女性癌癥死亡的主要原因之一［1］。先前的研究表明，雌激素受體（estrogen receptor,ER）陽(yáng)性乳腺癌約占乳腺癌的70%，雌激素受體α（ERα）在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用［2-4］。ERα是一種核受體，由幾個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：募集轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的N端激活功能域1（AF1）和C端激活功能域2（AF2），與靶基因的雌激素反應(yīng)元件結(jié)合的DNA結(jié)合域（DBD）［5］。ERα的活性主要受雌激素調(diào)節(jié)，ERα的激活促進(jìn)了許多調(diào)控致癌過程的靶基因的轉(zhuǎn)錄，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和上皮/管腔細(xì)胞分化等過程［6，7］。內(nèi)分泌治療通過拮抗雌激素與ERα的結(jié)合，下調(diào)ERα或抑制雌激素的產(chǎn)生來(lái)抑制ERα信號(hào)通路的激活，結(jié)合手術(shù)和放射療法，顯著改善了ER陽(yáng)性乳腺癌患者的臨床結(jié)局［8］。然而，仍有部分ER陽(yáng)性的乳腺癌患者在內(nèi)分泌治療過程中產(chǎn)生獲得性耐藥，出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移［9-11］。因此，迫切需要可以預(yù)測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。

微小RNA（miRNA）是一類調(diào)節(jié)基因表達(dá)的短非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)度約為20～24個(gè)核苷酸，可通過與靶基因的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）堿基配對(duì)抑制信使RNA（mRNA）的翻譯或降解mRNA從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)［12］。許多證據(jù)表明，miRNA在細(xì)胞增殖分化、血管生成和代謝等各種生物過程發(fā)揮重要作用［13-15］。多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展也與miRNA的表達(dá)失調(diào)相關(guān)［16，17］，例如結(jié)腸癌［18，19］、肺癌［20］、胃癌［21］、鼻咽癌［22，23］等。有研究顯示，乳腺癌中也存在多種miRNA表達(dá)失調(diào)，且部分與ERα狀態(tài)有關(guān)［24］。例如，miRNA-519a的高表達(dá)與ER陽(yáng)性乳腺癌患者較差的生存率相關(guān)，且miRNA-519a上調(diào)可導(dǎo)致ER陽(yáng)性乳腺癌患者對(duì)他莫昔芬的耐藥。

因此，本研究旨在通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)建miRNA-臨床的預(yù)測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后的模型，用于有效選擇高?；颊吆皖A(yù)測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌患者的3年和5年生存率，從而有利于制定更有效的個(gè)體化治療決策。

1 資料與方法

1.1 下載與處理原始數(shù)據(jù)2019年11月15日從TCGA官方網(wǎng)站獲取乳腺癌患者miRNA表達(dá)譜和臨床數(shù)據(jù)，miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)中總共包括1 096例乳腺癌組織和104例正常乳腺組織，臨床數(shù)據(jù)中包括1 174例乳腺癌患者臨床病理信息。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理學(xué)確診為乳腺癌。（2）既有miRNA的樣品測(cè)序數(shù)據(jù)又有完整的臨床預(yù)后資料（生存狀態(tài)及生存時(shí)間）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）雌激素受體表達(dá)情況不明確。（2）生存時(shí)間未知或生存時(shí)間≤0 d。最后共納入730例乳腺癌患者，其中555例雌激素受體陽(yáng)性患者，175例雌激素受體陰性患者。從GEO中下載數(shù)據(jù)集GSE37405（GPL 13703），該數(shù)據(jù)集包含60例ER陽(yáng)性乳腺癌患者的miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，患者均接受他莫昔芬治療，其中乳腺癌復(fù)發(fā)患者和未復(fù)發(fā)患者各30例。

1.2 篩選ER陽(yáng)性乳腺癌特異性差異miRNA以|log2FC|≥2，F(xiàn)DR＜0.05為篩選條件，使用R3.6.0軟件中的edgeR包分別篩選出ER陽(yáng)性乳腺癌差異表達(dá)的miRNA以及ER陰性乳腺癌中差異表達(dá)的miRNA，并使用ggplot2和pheatmap包繪制火山圖和熱圖。使用VennDiagram包繪制韋恩圖篩選出ER陽(yáng)性乳腺癌特異性上調(diào)和下調(diào)的差異miRNA。

1.3 構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式和miRNA-臨床預(yù)后模型篩選得到的ER陽(yáng)性乳腺癌特異性差異miRNA進(jìn)行Lasso回歸分析，篩選出與生存相關(guān)miRNA，根據(jù)每個(gè)miRNA的回歸系數(shù)，構(gòu)建基于miRNA表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式。繪制受試者工作曲線（ROC）評(píng)估m(xù)iRNA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的預(yù)測(cè)性能，根據(jù)ROC曲線選擇最佳臨界風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將ER陽(yáng)性乳腺癌患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組，比較兩組患者之間生存的差異及miRNA的表達(dá)情況。進(jìn)一步通過單因素和多因素Cox回歸分析結(jié)合臨床病理因素和miRNA風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分構(gòu)建預(yù)測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后的預(yù)后模型，并使用rms包繪制列線圖。

1.4 評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式和miRNA-臨床預(yù)后模型的預(yù)測(cè)性能繪制風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式和miRNA-臨床預(yù)后模型的ROC曲線并計(jì)算曲線下面積（AUC）評(píng)估模型的預(yù)測(cè)能力。繪制校準(zhǔn)曲線評(píng)估模型的準(zhǔn)確性。

1.5 靶基因預(yù)測(cè)和功能富集分析通過Starbase預(yù)測(cè)miRNA的候選靶基因。選擇至少3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)重疊的基因作為miRNA的靶基因。使用Cytoscape可視化miRNA與靶基因之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。最后，使用DAVID 6.8進(jìn)行靶基因的GO功能富集和KEGG通路富集分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析正態(tài)分布的數(shù)值變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，t檢驗(yàn)用于組間比較。偏態(tài)分布的數(shù)值變量采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）描述，Mann-WhitneyU檢驗(yàn)用于組間比較。分類變量采用頻數(shù)（構(gòu)成比）描述，χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)用于組間比較。Lasso回歸分析用于篩選與預(yù)后相關(guān)miRNA并構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式。使用單因素Cox回歸和多因素Cox回歸分析構(gòu)建miRNA-臨床預(yù)測(cè)模型，并使用R中rms包繪制列線圖。survival ROC包繪制ROC曲線評(píng)估了列線圖預(yù)測(cè)能力，校準(zhǔn)曲線用于評(píng)估模型的準(zhǔn)確性。使用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，并使用Log-rank檢驗(yàn)比較生存率。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用R3.6.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 患者的基線特征共555名ER陽(yáng)性乳腺癌患者納入研究，用隨機(jī)抽樣法按1∶1比例分為訓(xùn)練集278例和驗(yàn)證集277例，訓(xùn)練集用于構(gòu)建預(yù)測(cè)模型，驗(yàn)證集用于驗(yàn)證預(yù)測(cè)模型效能。兩組基本情況比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組具有可比性。所有患者的5年總生存率為91.7%。

2.2 篩選ER陽(yáng)性乳腺癌與生存相關(guān)的特異性差異miRNA從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了乳腺癌的miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，包括555例ER陽(yáng)性乳腺癌，175例ER陰性乳腺癌和104正常組織樣本。使用R3.6.0軟件中的edgeR包分別篩選出ER陽(yáng)性乳腺癌差異表達(dá)的miRNA和ER陰性乳腺癌差異表達(dá)的miRNA（|log2FC|≥2，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率FDR＜0.05）。根據(jù)兩組上調(diào)的miRNA和下調(diào)的miRNA分別繪制韋恩圖，選擇ER陽(yáng)性乳腺癌非交集部分miRNA為ER陽(yáng)性乳腺癌特異性miRNA，其中5個(gè)miRNA在ER陽(yáng)性乳腺癌特異性上調(diào)，17個(gè)miRNA在ER陽(yáng)性乳腺癌特異性下調(diào)。為了進(jìn)一步篩選與生存相關(guān)的miRNA，在訓(xùn)練集中對(duì)22個(gè)miRNA進(jìn)行了Lasso回歸，使用交叉驗(yàn)證以建立風(fēng)險(xiǎn)模型，最終篩選出4個(gè)與生存相關(guān)的miRNA，分別為miR-331、miR-615、miR-653、miR-887（見圖1）。

圖1 ER陽(yáng)性與ER陰性乳腺癌下調(diào)的miRNA的韋恩圖（A）和上調(diào)的miRNA的韋恩圖（B）以及Lasso回歸分析篩選miRNA(C)和交叉驗(yàn)證結(jié)果(D)

2.3 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式的建立和miRNA-臨床預(yù)后模型的構(gòu)建根據(jù)Lasso回歸得到相應(yīng)的系數(shù)，建立立風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=0.098×miR-331exp+0.122×miR-615exp+0.102×miR-653exp+0.113×miR-887exp。根據(jù)此方程，計(jì)算每個(gè)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，并根據(jù)ROC曲線的最佳臨界風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（風(fēng)險(xiǎn)得分為1.757）將訓(xùn)練集患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組（n=189）的和高風(fēng)險(xiǎn)組（n=89），驗(yàn)證集也分為低風(fēng)險(xiǎn)組（n=73）和高風(fēng)險(xiǎn)組（n=204）。Kaplan-Meier生存分析表明，在訓(xùn)練集（P=0.000 26）和驗(yàn)證集（P＜0.000 1）中，高風(fēng)險(xiǎn)組的預(yù)后比低風(fēng)險(xiǎn)組差（圖2）。隨后，將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分作為變量，結(jié)合其他臨床病理特征進(jìn)行單變量和多變量Cox回歸分析來(lái)識(shí)別與預(yù)后相關(guān)的危險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示TNM分期（HR=5.068，95%CI：1.799～14.278，P=0.002）、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（HR=1.191，95%CI：1.030～1.377，P=0.018）和術(shù)后是否放療（HR=0.411，95%CI：0.176～0.965，P=0.041）是預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表1）。將上述危險(xiǎn)因素用于構(gòu)建miRNA-臨床預(yù)后模型并繪制列線圖，在列線圖中，每個(gè)變量的得分相加計(jì)算總分，通過總分評(píng)估患者的3年和5年生存率（圖3）。

圖2 訓(xùn)練集（A）和驗(yàn)證集（B）中高低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分組患者的生存曲線

表1 影響ER陽(yáng)性乳腺癌預(yù)后的臨床病理因素的單因素和多因素Cox回歸分析

圖3 基于4個(gè)miRNA表達(dá)的預(yù)測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌患者3年和5年生存率的列線圖

2.4 評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和miRNA-臨床預(yù)后模型的預(yù)測(cè)效能繪制風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和基于miRNA-臨床預(yù)后模型的ROC曲線并計(jì)算AUC值以評(píng)估模型的預(yù)測(cè)能力。在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中，miRNA-臨床預(yù)后模型預(yù)測(cè)3年生存率的AUC分別為0.768和0.909，預(yù)測(cè)5年生存率的AUC分別為0.849和0.860（圖4）。

圖4 訓(xùn)練集（A）和驗(yàn)證集（B）評(píng)估m(xù)iRNA-臨床預(yù)后模型3年和5年預(yù)測(cè)能力的ROC曲線

2.5 miRNA在他莫昔芬治療患者中的表達(dá)從基因公共表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）中下載數(shù)據(jù)集GSE37405（GPL 13703），該數(shù)據(jù)集包含30例他莫昔芬治療后未復(fù)發(fā)患者及30例他莫昔芬治療后復(fù)發(fā)患者的miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，分析4個(gè)miRNA在兩組間的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與未復(fù)發(fā)組相比，復(fù)發(fā)患者miR-331的表達(dá)水平顯著升高，而兩組之間的miR-615、miR-653和miR-887的水平?jīng)]有明顯差異（圖5）。miR-331可能和ER陽(yáng)性乳腺癌他莫昔芬耐藥相關(guān)。

圖5 他莫昔芬治療后未復(fù)發(fā)組和復(fù)發(fā)組中4個(gè)miRNA的表達(dá)水平

2.6 mi-331的靶基因的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析GO功能富集分析表明，miR-331的靶基因細(xì)胞組成（圖6A）主要富集在細(xì)胞核和核質(zhì)，生物過程（圖6B）主要參與在RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的終止、核轉(zhuǎn)錄mRNA poly（A）尾巴的縮短和內(nèi)皮細(xì)胞增殖的調(diào)控，分子功能（圖6C）主要參與蛋白質(zhì)結(jié)合。KEGG通路分析（圖6D）結(jié)果表明，miR-331的靶基因主要參與mRNA監(jiān)視途徑，Rap1信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路相關(guān)。

圖6 miR-331的GO功能富集和KEGG通路富集

3 討論

高通量測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)基因組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以從分子角度探索與惡性腫瘤診斷，治療與預(yù)后密切相關(guān)的標(biāo)志物。通過分子標(biāo)志物對(duì)患者生存率的預(yù)測(cè)有助于制定個(gè)體化的臨床決策。許多研究［25-29］表明，miRNA與ER陽(yáng)性乳腺癌的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。Mulrane等［30］研究發(fā)現(xiàn)miR-187在乳腺癌中的高表達(dá)可能與更具侵略性的表型相關(guān)，且miR-187與乳腺癌預(yù)后不良相關(guān)，是預(yù)測(cè)患者生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。Okuda等［31］研究表明，miR-7可以通過下調(diào)KLF4基因的表達(dá)進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。有研究者［32］發(fā)現(xiàn)ER陽(yáng)性患者的腫瘤中miRNA-375水平顯著高于ER陰性乳腺癌患者，且miRNA-375在他莫昔芬耐藥細(xì)胞中下調(diào)，其重新表達(dá)可以抑制MTDH基因表達(dá)從而恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)他莫昔芬敏感性，同時(shí)也抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和逆轉(zhuǎn)EMT樣特性。此外，Gong等［33］建立了一個(gè)基于miRNA的模型來(lái)預(yù)測(cè)激素受體陽(yáng)性HER2陰性乳腺癌患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。因此，在多種癌癥中基于miRNA的預(yù)測(cè)模型對(duì)預(yù)測(cè)患者的生存或復(fù)發(fā)具有重要意義。傳統(tǒng)的生物學(xué)方法驗(yàn)證miRNA和患者的預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)既耗時(shí)又昂貴，隨著生物學(xué)數(shù)據(jù)的積累，我們可以利用大量數(shù)據(jù)分析miRNA和腫瘤的相關(guān)性并開發(fā)預(yù)測(cè)模型來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤患者的預(yù)后及治療反應(yīng)，通過另一數(shù)據(jù)集的驗(yàn)證檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃?，建立基于miRNA的預(yù)測(cè)模型既對(duì)個(gè)體化治療方案的選擇具有重要的參考價(jià)值。也可為miRNA與腫瘤的相關(guān)性進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供理論依據(jù)。

在本研究中，我們從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，通過差異表達(dá)分析和Lasso回歸發(fā)現(xiàn)了4種ER陽(yáng)性乳腺癌特異性表達(dá)上調(diào)的miRNA（miR-331、miR-615、miR-653、miR-887）并建立了miRNA表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式。根據(jù)ROC曲線的最佳臨界風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與ER陽(yáng)性乳腺癌患者的總生存率顯著相關(guān)。通過Cox回歸分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和臨床病理因素與預(yù)后的關(guān)系，構(gòu)建了miRNA-臨床預(yù)測(cè)模型用于預(yù)測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌患者的預(yù)后。該模型預(yù)測(cè)3年和5年生存率的AUC值分別為0.768和0.849，表明其具有良好的預(yù)測(cè)性能。模型中包含的4個(gè)miRNA中，部分miRNA已有試驗(yàn)證實(shí)與乳腺癌相關(guān)。Jiang等［34］發(fā)現(xiàn)miR-331在乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，miR-331的過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和預(yù)后不良有關(guān)。Lei等［35］發(fā)現(xiàn)miR-615-3p在乳腺癌細(xì)胞和組織中特別是在轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞和組織中顯著升高，miR-615-3p通過抑制PICK 1基因表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的EMT過程。因此，我們構(gòu)建的miRNA-臨床的列線圖可能是ER陽(yáng)性乳腺癌患者生存預(yù)測(cè)的重要工具，有助于制定個(gè)性化治療策略。隨后我們利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中GSE37405數(shù)據(jù)集分析了4個(gè)miRNA在他莫昔芬治療后復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)兩組之間的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-331在他莫昔芬治療后復(fù)發(fā)組中表達(dá)明顯高于未復(fù)發(fā)組，提示miR-331可能與ER陽(yáng)性乳腺癌患者發(fā)生他莫昔芬耐藥相關(guān)。進(jìn)一步進(jìn)行了miR-331靶基因的GO和KEGG途徑的分析，結(jié)果顯示miR-331可能在蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄、mRNA監(jiān)視通路、MAPK信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用。

綜上所述，我們構(gòu)建的預(yù)測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌患者生存的miRNA-臨床風(fēng)險(xiǎn)模型，該模型結(jié)合了4個(gè)miRNA的表達(dá)情況和臨床危險(xiǎn)因素，可預(yù)測(cè)ER陽(yáng)性乳腺癌患者的3年和5年生存率，且建立的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式可有效地識(shí)別ER陽(yáng)性乳腺癌中的高危患者。因此，該預(yù)測(cè)模型對(duì)制定個(gè)性化治療決策有重要意義。但在該模型廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐之前，仍需要進(jìn)行多中心、大規(guī)模、前瞻性研究以驗(yàn)證該預(yù)測(cè)工具。