譚 堯 熊雨靜 徐 檬 顏 彬 曹 璜 胡俊波 吳緒峰 王漢明

1武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 湖北 武漢 430062；2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬湖北婦幼保健院 湖北 武漢 430070

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，2020年全球估計(jì)新增宮頸癌患者60.4萬(wàn)人，死亡病例約34.2萬(wàn)［1］。近年來宮頸鱗癌的發(fā)病率在顯著下降，但宮頸腺癌發(fā)病比例則逐年上升，宮頸腺癌與宮頸鱗癌呈現(xiàn)明顯不同的生物學(xué)行為，相比較鱗癌，人們對(duì)腺癌的認(rèn)識(shí)存在明顯不足。TFF3是三葉因子家族（Trefoil factor，TFFs）蛋白成員之一，主要分布于小腸和結(jié)腸的杯狀細(xì)胞［2］，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)黏膜修復(fù)、促進(jìn)腫瘤侵襲等功能［3］，已證實(shí)其在多種其他組織腺癌中表達(dá)，并與腫瘤惡性程度、預(yù)后不良密切相關(guān)［4，5］。已有文獻(xiàn)報(bào)道過表達(dá)TFF3可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞株的增殖與抗凋亡［6］，但TFF3在不同宮頸癌組織類型的表達(dá)及其臨床意義尚不明確。該文采用免疫組化的方法進(jìn)一步探討TFF3在宮頸癌組織標(biāo)本中的表達(dá)及其臨床意義，為全面認(rèn)識(shí)TFF3在宮頸癌中的功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料標(biāo)本來源于2008—2018年湖北省婦幼保健院病理科存檔的98例宮頸癌組織蠟塊，均有完整的臨床資料與隨訪資料。宮頸腺癌組共48例，患者年齡17～75歲，中位年齡44歲；臨床分期Ⅰ期40例、Ⅱ～Ⅲ期8例；分化程度G1期21例，G2～G3期27例；腫瘤直徑＜4 cm 32例，腫瘤直徑≥4 cm 16例；其中腺癌手術(shù)治療20例，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)陽(yáng)性3例，脈管侵犯5例。宮頸鱗癌組共50例，患者年齡27～85歲，中位年齡50歲；臨床分期Ⅰ期15例、Ⅱ～Ⅲ期35例；分化程度角化型21例，非角化型27例；腫瘤直徑＜4 cm 21例，腫瘤直徑≥4 cm 29例；其中鱗癌手術(shù)治療32例，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)陽(yáng)性7例，脈管侵犯15例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)（SP）法 兔抗人TFF3單克隆抗體（EPR3974）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司（工作濃度為2μg/mL）；通用二步法檢測(cè)試劑盒（PV-9000）、DAB顯色試劑盒（ZLI-9017）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。切片染色前根據(jù)要求行檸檬酸緩沖液高溫抗原修復(fù)，其余操作過程均按試劑盒說明書完成。

1.2.2 圖像采集與分析 采用徠卡?DM 4000顯微鏡觀察并獲取圖像。Image J（NIH，Bethesda，Maryland，版本號(hào)1.48）進(jìn)行陽(yáng)性定量分析［7］，原始彩色圖像解卷積產(chǎn)生DAB圖像和蘇木素圖像。DAB顯色圖像以光密度（OD）值分析，OD值強(qiáng)度范圍為0～255。背景純白OD值接近0，DAB著色越深OD值越大，表明物質(zhì)的量越多。其中OD值范圍0～55為陰性，56～115為弱陽(yáng)性（+），116～175為強(qiáng)陽(yáng)性（），176～235為強(qiáng)陽(yáng)性（）。根據(jù)下列公式計(jì)算圖片免疫組化總得分。評(píng)分=（染色面積×該染色強(qiáng)度得分）/總面積。

此外，在區(qū)域中≥66%像素百分比的圖像都將被直接分配該區(qū)域的分?jǐn)?shù)。同時(shí)將圖片上各點(diǎn)的OD值累加起來，即為積分光密度值（IOD值），此值與檢測(cè)物質(zhì)的總量成正比。IOD值除以目標(biāo)分布區(qū)域面積，得到平均光密度值（AOD值），此值反映了目標(biāo)物質(zhì)的單位面積濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，定量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異性的統(tǒng)計(jì)推斷采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，組間差異性統(tǒng)計(jì)推斷采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間差異采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)算卡方和P。患者術(shù)后生存率的評(píng)價(jià)采用生存曲線分析，生存曲線、散點(diǎn)圖的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)采用GraphPad Prism 8軟件。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TFF3在宮頸鱗癌與腺癌中的表達(dá)TFF3主要表達(dá)于宮頸癌細(xì)胞胞質(zhì)中，宮頸腺癌與宮頸鱗癌中均有表達(dá)（見圖1A、1B）。TFF3在宮頸癌組織表達(dá)的平均IOD、平均AOD分別是2.39×106、0.87，表達(dá)陽(yáng)性率為100%（98/98）。其中鱗癌組織中TFF3表達(dá)的平均IOD、平均AOD分別是1.45×106、0.63；宮頸腺癌組織中TFF3的平均IOD、平均AOD值分別為3.37×106、1.12，二者間存在顯著差異（P＜0.05）（見圖1C、1D）。宮頸 腺癌患者 的TFF3強(qiáng)陽(yáng)性34例，陽(yáng)性14例，強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率70.83%；宮頸鱗癌組強(qiáng)陽(yáng)性6例，陽(yáng)性44例（其中弱陽(yáng)性6例），強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率僅為12%，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見表1。

圖1 TFF3在宮頸腺癌與鱗癌中表達(dá)水平比較

表1 TFF3在宮頸腺癌與鱗癌中表達(dá)水平比較

2.2 宮頸癌患者中TFF3表達(dá)與臨床病理參數(shù)間關(guān)系通過研究，可知TFF3的表達(dá)強(qiáng)度與宮頸癌患者年齡、臨床分期、脈管侵犯有一定關(guān)系。在宮頸癌組織中，年齡＜45歲、年齡≥45歲TFF3的IOD中位數(shù)分別為2.62×106、1.59×106，二者間存在顯著差異（P＜0.05）。FIGO分期Ⅰ期、Ⅱ～Ⅲ期TFF3的IOD中位數(shù)分別為2.62×106、1.62×106，二者間存在顯著差異（P＜0.05）。有脈管侵犯、無脈管侵犯TFF3的IOD中位數(shù)分別為2.55×106、1.26×106，二 者 間 存 在 顯 著 差 異（P＜0.05）。TFF3的表達(dá)強(qiáng)度與宮頸癌患者分化程度、淋巴結(jié)陽(yáng)性、腫瘤直徑無明顯關(guān)系（P＞0.05），具體結(jié)果見表2。

表2 宮頸癌患者中TFF3表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性

2.3 宮頸鱗癌患者中TFF3表達(dá)與臨床病理參數(shù)間關(guān)系在宮頸鱗癌中，TFF3的表達(dá)強(qiáng)度與宮頸鱗癌患者臨床分期、腫瘤直徑有關(guān)，其中，F(xiàn)IGO分期Ⅱ～Ⅲ期的IOD中位數(shù)為1.53×106，明顯高于Ⅰ期（1.03×106），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。腫瘤直徑≥4 cm的IOD中位數(shù)為1.54×106，明顯高于腫瘤直徑＜4 cm（1.13×106），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TFF3的表達(dá)強(qiáng)度與宮頸鱗癌患者年齡、分化程度、淋巴結(jié)陽(yáng)性、脈管侵犯無關(guān)（P＞0.05），具體結(jié)果見表3。

表3 宮頸鱗癌患者中TFF3表達(dá)與臨床病理參數(shù)間相關(guān)性

2.4 宮頸癌患者中TFF3表達(dá)強(qiáng)度與手術(shù)預(yù)后的關(guān)系對(duì)所有宮頸癌手術(shù)患者IOD值取其中位數(shù)，低于中位數(shù)則為低表達(dá)組，高于中位數(shù)則為高表達(dá)組。通過分析，低表達(dá)組中位生存期為4.4年，高表達(dá)組中位生存期4.0年，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可知TFF3的表達(dá)強(qiáng)度與宮頸癌患者預(yù)后無明顯關(guān)系，具體結(jié)果見圖2。

3 討論

近年來，隨著宮頸防癌篩查的普及和HPV疫苗的應(yīng)用，宮頸癌發(fā)病率和死亡率顯著降低［8］。但宮頸腺癌發(fā)病率和死亡率則逐年上升且有年輕化的趨勢(shì)。20世紀(jì)50年代，美國(guó)宮頸腺癌占總宮頸癌的比例約為5%，現(xiàn)在則已達(dá)20%～30%［9］，約60.3%的宮頸腺癌患者年齡小于50歲，其中超過50%患者小于40歲。目前，宮頸腺癌的死亡率較同期鱗癌高20%以上［10］，這可能與宮頸腺癌的惡性生物學(xué)行為相關(guān)，并非所有的腺癌都有人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的感染，而腺癌病變位置較深，現(xiàn)有的篩查手段診斷效果欠佳［11］，腺癌對(duì)化療和放療敏感性較鱗癌低［12］。因此對(duì)宮頸腺癌進(jìn)行更深入的研究對(duì)改善宮頸腺癌患者的預(yù)后有重要的意義。

TFF3在多種組織腺癌中高表達(dá)，且與腫瘤不良預(yù)后密切相關(guān)。如在原發(fā)性胃癌中TFF3表達(dá)量越高提示患者預(yù)后越差［13］。在早期胰腺癌中，TFF3的表達(dá)量隨著疾病的進(jìn)展逐漸增高［14］。在肺癌中，TFF3在肺腺癌中高表達(dá)，而在肺鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá)，其表達(dá)差異為明確肺癌組織學(xué)類型提供了特異性標(biāo)記物［15］。目前在婦科惡性腫瘤中TFF3研究報(bào)道較少。宮頸癌中，Yuan等［16］通過上調(diào)TFF3的表達(dá)抑制了HeLa細(xì)胞的凋亡，并促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲。徐昕［17］同樣在宮頸癌細(xì)胞系中探究發(fā)現(xiàn)TFF3通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)而激活Twist1基因的表達(dá)，從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移，并抑制其凋亡。周秀枝［18］在正常宮頸、低級(jí)別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高級(jí)別宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）及宮頸癌組織中檢測(cè)TFF3的表達(dá)，明確TFF3與宮頸病變的進(jìn)程密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸腺癌組織中TFF3的IOD值及AOD值顯著高于鱗癌組織，宮頸腺癌患者的TFF3強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率（70.83%）明顯高于鱗癌組織（12%），說明TFF3表達(dá)水平與宮頸癌組織病理學(xué)類型密切有關(guān)，宮頸腺癌中TFF3表達(dá)水平明顯高于鱗癌，這與Qu等［15］在肺癌組織分型中發(fā)現(xiàn)腺癌TFF3表達(dá)量高于鱗狀細(xì)胞癌的結(jié)果相符。TFF3在宮頸癌組織中的差異性表達(dá)，以及在腺癌中的高表達(dá)，結(jié)合Yuan等［16］已經(jīng)證實(shí)TFF3與腺癌細(xì)胞株HeLa的惡性生物學(xué)行為相關(guān)，說明TFF3在宮頸腺癌發(fā)生發(fā)展研究中發(fā)揮著重要作用，可能為宮頸腺癌診斷與治療提供一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

在宮頸癌臨床病理特征方面，年齡＜45歲患者TFF3的IOD中位數(shù)為2.62×106，明顯高于年齡≥45歲患者（1.59×106），二者間存在顯著差異（P＜0.05）。說明TFF3的表達(dá)水平與宮頸癌患者的年齡相關(guān)，年齡越低，TFF3的表達(dá)水平越高。其中，小于45歲宮頸腺癌患者28人，鱗癌17人，這符合近年來宮頸腺癌發(fā)病年齡年輕化的流行病學(xué)特征。在宮頸鱗癌組中，TFF3的表達(dá)水平與臨床分期、腫瘤直徑呈正相關(guān)，說明TFF3可能與宮頸癌的進(jìn)展過程相關(guān)。

綜上所述，TFF3在宮頸癌的表達(dá)水平與組織學(xué)類型密切相關(guān)，并在一定程度上參與了宮頸癌的惡性進(jìn)展，全面深入研究TFF3將有助于宮頸癌預(yù)后的改善。