王慶義 劉洪智 高傳玉 原 芳 徐 予 田 煥 劉 琳 安松濤 張 優(yōu) 王素琴張鵬飛 石亞楠 魏晶晶

1河南省人民醫(yī)院/鄭州大學(xué)人民醫(yī)院心功能科 河南 鄭州 450003；河南省人民醫(yī)院/鄭州大學(xué)人民醫(yī)院/阜外華中醫(yī)院2心血管內(nèi)科，3超聲科 河南 鄭州 451464

阿霉素是臨床上常用的高效蒽醌類抗腫瘤藥物，長期使用阿霉素治療最嚴(yán)重的副作用是伴有充血性心力衰竭的擴張型心肌病，預(yù)后極差，從而限制了其臨床應(yīng)用。導(dǎo)致阿霉素心肌病的機制非常復(fù)雜，包括氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、線粒體功能障礙、鈣超載等，但是基于這些機制給予相應(yīng)的治療仍未獲得更好的治療效果［1］。有研究表明，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）參與阿霉素心肌病左室重構(gòu)和心 力 衰 竭 的 發(fā) 生 發(fā) 展［2］。腦 啡 肽 酶（neprilysin，NEP）屬于一種廣譜中性肽鏈內(nèi)切酶，利鈉肽系統(tǒng)及血管緊張素Ⅱ等肽類可通過其降解。腦啡肽酶抑制劑可增加利鈉肽水平，與血管緊張素受體抑制劑（angiotensin receptor blockers，ARBs）類藥物聯(lián)合，即可上調(diào)有益心衰的利鈉肽系統(tǒng)，又可拮抗不利心衰的RAAS系統(tǒng)［3］。首種血管緊張素受體腦啡肽酶抑制劑（angiotensin receptor neprilysin inhibitor，ARNI）類藥物L(fēng)CZ696沙庫巴曲/纈沙坦（Entresto，諾欣妥），是一種由腦啡肽酶抑制劑前體藥物AHU 377（即沙庫巴曲和纈沙坦）組成的單分子藥物。其能否通過上調(diào)心房利鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）改善阿霉素心肌病心力衰竭左室重構(gòu)及心功能，目前尚無研究。本研究目的是探討LCZ696能否通過上調(diào)ANP從而防止阿霉素心肌病大鼠心肌纖維化和心功能不全。

1 材料與方法

1.1 實驗材料Wistar大鼠［成年雄性，SPF級，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0010］；鹽酸阿霉素（CAS#25316-40-9，源葉生物）；LCZ696（諾華公司饋贈）；大鼠心鈉肽（ANP）試劑盒（MM-21097R1）；大鼠環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）試劑盒（MM-0027R1）；大鼠N端前腦鈉素（NT-proBNP）試劑盒（MM-0329R1）；改良Masson三色染色液（G1345，Solarbio）。

1.2 阿霉素心肌病模型建立及給藥處理選取34只健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量300～350 g，所有動物于動物實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，分3組：（1）模型組（n=12），注射用鹽酸阿霉素2.5 mg/kg，腹腔注射，每周1次，連續(xù)6周；（2）阿霉素心肌病模型+ARNI類藥物L(fēng)CZ696治療組（LCZ696治療組，n=12），阿霉素給藥方法同模型組，在首次注射阿霉素前1周開始給予LCZ696治療，按照60 mg/（kg·d）劑量灌胃，持續(xù)7周；（3）正常對照組（n=10），用相同容量的生理鹽水代替阿霉素，給藥方法同模型組。試驗第7周，利用超聲心動圖測量大鼠左室結(jié)構(gòu)和功能，然后處死動物，留取外周血和左室心肌組織標(biāo)本，一部分多聚甲醛固定，蠟塊包埋，一部分置于-80℃冷凍保存，以檢測其它指標(biāo)。

1.3 超聲心動圖檢測心臟結(jié)構(gòu)及功能3組大鼠分別于注射完成1周后（第7周），20%烏拉坦麻醉，進行經(jīng)胸高頻超聲心動圖（美國Visualsonics公司vevo2100彩色超聲顯像儀）檢查，探頭頻率為15 MHz。在二維切面上顯示胸骨旁左心長軸觀，然后采用M型超聲心動圖方法分別測量各組大鼠的左心室舒張內(nèi)徑（left ventricular end diastolic dimension，LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室短軸 縮 短 分 數(shù)（left ventricular fraction shortening，LVFS），所有的參數(shù)均取3次測量后的平均值。

1.4 ELISA檢測大鼠血漿ANP、cGMP和NTproBNP的濃度采用雙抗夾心法，分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中加樣品50μL，將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μL，空白孔除外。溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60 min。配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。顯色：每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。終止：每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。測定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD）值。測定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進行。

1.5 左室心肌Masson染色心肌組織固定于4%多聚甲醛固定液中，常規(guī)脫水包埋。切片厚4μm，常規(guī)脫蠟至水。切片入Bouin液，置于37℃的溫箱內(nèi)24 h進行媒染，然后流水沖洗至切片上的黃色消失，天青石藍(lán)染液滴染3 min，稍水洗。酸性乙醇分化液分化數(shù)秒，流水沖洗10 min。麗春紅品紅染色滴染10 min，水洗。磷鉬酸溶液處理10 min，棄液，直接滴入苯胺藍(lán)染色液染5 min。弱酸處理2 min，95%的乙醇快速脫水3次。二甲苯透明3次，每次2 min。中性樹脂封固，鏡下觀察切片。采用圖像分析系統(tǒng)，通過灰度調(diào)節(jié)區(qū)別膠原和非膠原成分，測量心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)，CVF=膠原纖維染色面積/總面積×100%，每張切片均隨機取5個視野測量，計算其均值。

1.6 熒光定量RT-PCR（RT-qRCR）取左室心肌組織樣本經(jīng)液氮研磨成粉末，加入TRIzol裂解液后再次研磨，收集組織勻漿液以提取總RNA。利用紫外可見分光光度計測定RNA的濃度和純度（OD260/OD280）。將RNA通過逆轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。利用熒光PCR儀進行熒光定量PCR。引物序列由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成（表1）。β-actin作為內(nèi)參，TGF-β的相對表達(dá)量根據(jù)2-△△Ct法計算。

表1 引物序列及產(chǎn)物長度

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，計量資料表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。正態(tài)分布的連續(xù)變量進行比較采用One-way ANOVA分析，兩兩比較采用Tukey方法，對于非正態(tài)分布及方差不齊的數(shù)據(jù)采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 死亡率正常對照組大鼠全部存活；模型組5只大鼠死亡，死亡率為41.7%；LCZ696治療組2只大鼠死亡，死亡率為16.7%，死因主要為慢性心力衰竭，三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 超聲心動圖結(jié)果與正常對照組相比，模型組大鼠的LVEF和LVFS均顯著降低，而LVEDD和LVESD均顯著升高（P＜0.05）；而與模型組相比，LCZ696治療組大鼠的LVEF和LVFS顯著升高，而LVEDD和LVESD均顯著降低（P＜0.05），表明LCZ696可改善阿霉素心肌病心力衰竭大鼠心功能，結(jié)果如表2所示。

表2 各組大鼠超聲心動圖結(jié)果

2.3 LCZ696對大鼠左室心肌纖維化的影響Masson染色結(jié)果顯示正常對照組大鼠僅有少量膠原纖維存在于血管周圍和心肌細(xì)胞之間，而模型組大鼠左室心肌間質(zhì)膠原纖維增多明顯，紊亂排列，壞死的肌纖維被藍(lán)色的膠原纖維取代，膠原容積分?jǐn)?shù)明顯升高（P＜0.05）。ARNI類藥物L(fēng)CZ696治療組與模型組相比，纖維化明顯減輕，膠原容積分?jǐn)?shù)明顯降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 Masson染色觀察大鼠心肌組織纖維化情況（×100）

2.4 LCZ696對阿霉素心肌病心力衰竭大鼠血漿ANP、cGMP和NT-proBNP的影響 通過ELISA方法檢測各組大鼠血漿中ANP、cGMP和NTproBNP的濃度，結(jié)果如圖2所示。與正常對照組相比，模型組中ANP、cGMP、和NT-proBNP升高（P＜0.05）；而LCZ696治療組與模型組相比，NTproBNP顯著降低（P＜0.05），而ANP和cGMP進一步升高，具有顯著性差異（P＜0.05）。

圖2 ELISA檢測血漿中ANP、NT-pr oBNP和cGM P濃度

2.5 LCZ696對模型組大鼠心肌組織中TGF-β表達(dá)的影響結(jié)果如圖3所示。與正常對照組相比，模型組中TGF-β的mRNA水平顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組相比，ARNI類藥物L(fēng)CZ696治療組TGF-βmRNA水平顯著下調(diào)（P＜0.05）。

圖3 ARNI類藥物對阿霉素心肌病大鼠心肌組織中TGF-βm RNA表達(dá)的影響

3 討論

阿霉素是臨床上常用的腫瘤化療藥物，長期使用阿霉素治療最嚴(yán)重的副作用是伴有充血性心力衰竭的擴張型心肌?。?］。本研究結(jié)果顯示，阿霉素誘導(dǎo)的心肌病心力衰竭模型組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維增多明顯，紊亂排列，左室心肌中心肌纖維化相關(guān)的TGF-β表達(dá)升高；超聲心動圖也顯示左室擴大，左心收縮功能明顯下降，心衰標(biāo)記物NT-proBNP明顯升高，提示阿霉素心肌病心力衰竭模型組存在明顯的心肌纖維化和收縮功能減退。

LCZ696是諾華公司研發(fā)的首種血管緊張素受體-腦啡肽酶抑制劑。Burke等［4］研究發(fā)現(xiàn)LCZ696與單用纈沙坦相比，可明顯抑制腹主動脈縮窄小鼠心衰模型心肌纖維化及心功能減退，與ANP/NPRA/cGMP通路上調(diào)從而RhoA磷酸化失活抑制心臟成纖維細(xì)胞增殖激活有關(guān)。Maslov等［5］研究發(fā)現(xiàn)LCZ696可改善主動脈瓣關(guān)閉不全導(dǎo)致的容量超負(fù)荷心力衰竭大鼠模型心功能及活動耐量，降低心肌纖維化，這一保護作用與ARB拮抗血管緊張素Ⅱ以及抑制腦啡肽酶導(dǎo)致血漿中ANP升高之間的協(xié)同作用有關(guān)。PROVE-HF研究亞組入選144例慢性收縮性心力衰竭患者，發(fā)現(xiàn)LCZ696治療后，外周血中ANP升高近2～4倍，血或尿中cGMP水平明顯升高，心功能明顯改善，且發(fā)現(xiàn)治療早期ANP升高越多，其長期治療左室逆重構(gòu)作用越顯著［6］。綜合上述研究，ARNI心衰治療獲益主要機制除了與抑制RAAS以外，還與抑制腦啡肽酶，從而使得利鈉肽系統(tǒng)尤其是ANP升高為主，ANP可通過利鈉肽A型受體（natriuretic peptide type A receptors，NPR-A），激活鳥苷酸環(huán)化酶（guanylate cyclases，GC），使得細(xì)胞內(nèi)第二信使（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）升高，進一步激活蛋白激酶G（protein kinase G，PKG），發(fā)揮利尿利鈉、外周血管擴張、拮抗RAAS、抗心肌纖維化等保護作用。本研究利用阿霉素心肌病心力衰竭大鼠模型，發(fā)現(xiàn)LCZ696治療組大鼠較模型組大鼠外周血中心衰標(biāo)記物NT-proBNP明顯下降，而外周血中ANP及cGMP濃度進一步升高，左室射血分?jǐn)?shù)和左室短軸縮短率較心衰模型組明顯改善，并且左室內(nèi)徑明顯降低，心肌間質(zhì)纖維化明顯改善，左室心肌中心肌纖維化相關(guān)的TGF-β表達(dá)降低，表明LCZ696可明顯改善阿霉素心肌病心力衰竭大鼠左室心肌纖維化及心功能，這種獲益可能與ANP和cGMP升高及抑制TGF-β表達(dá)有關(guān)。Miyagawa等［7］研究亦發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶1基因敲除雜合子小鼠通過降低內(nèi)皮素-1含量及升高ANP和cGMP含量，從而減輕阿霉素導(dǎo)致的心肌損傷及心功能減退。另外，有研究表明，LCZ696通過抑制Drp1介導(dǎo)的線粒體結(jié)構(gòu)和功能障礙或通過抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)或通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性從而減輕阿霉素心肌病左室心肌纖維化及改善心功能［8-10］。由此可見，LCZ696可逆轉(zhuǎn)或防止阿霉素引起的心肌纖維化及心力衰竭，與我們的研究結(jié)果一致。

綜上所述，在阿霉素導(dǎo)致的慢性心肌損傷和心肌病心力衰竭大鼠模型中，ARNI類藥物L(fēng)CZ696通過增加外周血中ANP和cGMP濃度及抑制左室心肌TGF-β表達(dá)，從而部分抑制阿霉素心肌病大鼠心肌纖維化、改善心功能。本研究為闡明ARNI類藥物治療心衰的作用機制及對阿霉素心臟毒性和心力衰竭的防治具有一定的意義。