彭艷芳 張瑩雯 張亞兵 柯浩亮 王秀萍

武漢大學(xué)中南醫(yī)院中醫(yī)科 湖北 武漢 430071

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF)是多種因素引起的以炎性細(xì)胞浸潤、肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)纖維增生、膠原纖維沉積為特征的彌漫性間質(zhì)性肺疾?。?］，具有慢性、進展性、致死性發(fā)展，預(yù)后差。臨床上治療肺纖維化大都會使用糖皮質(zhì)激素，但只對部分患者有效，并且長期使用副作用大。目前肺移植為國際公認(rèn)的最有效方法，但肺移植存在手術(shù)風(fēng)險大、捐助機構(gòu)的供應(yīng)有限，且肺移植后長期的抗免疫排斥治療，容易繼發(fā)感染死亡，從而限制了其在臨床上推廣使用。所以明確PF發(fā)病機制，尋找靶向治療PF的藥物顯得十分重要。

Toll樣 受 體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是TLRs家族中的一個關(guān)鍵成員，是與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的蛋白質(zhì)分子，而核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）是位于Toll樣受體家族下游的核轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控白細(xì)胞介素（IL-6）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1等多種基因參與炎癥反應(yīng)及增殖凋亡等過程，兩者協(xié)同，當(dāng)有炎癥等刺激后，機體會通過上調(diào)TLR4的表達(dá)而激活NF-κB通路，促進下游的炎性因子如IL-6、IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α的釋放［2］，從而導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)和肺纖維化發(fā)生。紫檀芪是存在于紫檀、葡萄、藍(lán)莓等植物的酚類化合物，具有預(yù)防氧化應(yīng)激反應(yīng)、抗腫瘤、抗炎等多種藥理活性［3］。我們前期研究提示紫檀芪可能通過調(diào)控NF-κB/TGF-β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白來減輕博來霉素導(dǎo)致的大鼠肺纖維化程度［4］。紫檀芪能否通過激活TLR4/NF-κB信號通路來緩解炎癥和氧化應(yīng)激損傷作用、從而抗肺纖維化等未見報道，故本研究基于TLR4/NF-κB信號通路進一步從炎癥、氧化應(yīng)激等方面探討紫檀芪對肺纖維化的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料SPF級健康雄性SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，每只體質(zhì)量200～250 g。紫 檀 芪（pterostilbene，PET；分子 式C16H16O3，上海哈靈生物科技有限公司），強的松片（浙江仙居制藥股份有限公司生產(chǎn)）；BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（ASPEN公司），谷胱甘肽（GSH）、羥脯氨酸（HYP）、總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒（南京建成公司），ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（ASPEN公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備、分組與給藥方法 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機分為正常對照組（A組）、模型組（B組）及強的松組（C組）、紫檀芪組（D組），每組10只。除正常對照組（正常組）外，其余3組大鼠參照Szapiel等［5］經(jīng)典造模方法誘導(dǎo)PF大鼠模型：1%戊巴比妥鈉溶液按40 mg/kg注射麻醉大鼠后仰臥固定于鼠臺上，消毒暴露氣管，向氣管內(nèi)快速注入博來霉素（BLM，5 mg/kg）誘導(dǎo)肺纖維化模型，待大鼠自然蘇醒后自由進食和飲水。于造模后第2天開始進行灌胃給藥，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，正常對照組和模型組予以DMSO溶劑10 mL/（kg·d），強的松組予以強的松混懸液3.0 mg/（kg·d），紫檀芪組以30 mg/（kg·d）給藥，連續(xù)3周。

1.2.2 病理學(xué)觀察 取各組大鼠左肺用10%的中性甲醛固定，常規(guī)制備肺組織石蠟切片，Masson染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.2.3 肺組織HYP、GSH、T-AOC測定 取右下肺組織于-80℃冰箱保存，采用比色法測定大鼠T-AOC，采用二硫代二硝基苯甲酸法測定大鼠GSH水平，采用堿水解法進行實驗計算出單位重量肺組織HYP的含量。

1.2.4 肺組織TNF-α、IL-1β、iNOS測定 免疫組化法（IHC）檢測，各組大鼠肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟，微波修復(fù)，沖洗封閉，去除BSA液，每張切片加入約50μL稀釋的一抗TNF-α（1∶100）、IL-1β（1∶50）、iNOS（1∶300）覆蓋組織，4℃過夜。PBS緩沖液洗滌，加二抗（1∶200），洗滌，DAB顯色，封片，采用Image Pro Plus軟件計算累積光密度值（IOD）值。

1.2.5 肺組織TLR4、NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平 采用Western Blot法檢測各組大鼠TLR4、NFκB p65蛋白表達(dá)量，使用軟件分析蛋白條帶灰度值。內(nèi)參蛋白是GAPDH。

1.2.6 RT-PCR檢測肺組織TLR4、NF-κB p65的mRNA表達(dá)水平 取大鼠右上肺組織20 mg，于1 mL預(yù)冷的TRIpure中充分研磨，離心，加入10μL RNase-Free Water，充分溶解RNA，配制qRT-PCR反應(yīng)體系，引物序列見表1。根據(jù)實時熒光定量PCR試劑盒說明書的方法檢測基因表達(dá)水平，通過2-△△Ct法進行計算mRNA表達(dá)量。

表1 q RT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間的比較采用t檢驗，多組間比較行單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫檀芪對大鼠肺組織病理學(xué)變化的影響通過Masson染色我們可以發(fā)現(xiàn)，正常對照組可見支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤、膠原沉積及纖維組織增生；模型組見肺組織中有較多的片狀實變區(qū)，局部肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁增厚，肺泡間隔有炎細(xì)胞浸潤及膠原沉積；紫檀芪組及強的松組肺泡炎及肺纖維化程度和范圍介于正常對照組和模型組之間。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織Masson染色觀察(Masson×200)

2.2 紫檀芪對肺纖維化大鼠肺組織中HYP、GSH、T-AOC的影響與正常對照組相比，模型組HYP含量明顯升高；而經(jīng)紫檀芪和強的松干預(yù)治療后則較模型組有明顯的降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與正常對照組相比，模型組肺組織GSH、T-AOC的表達(dá)下降（P＜0.01），紫檀芪組和強的松組GSH、T-AOC均高于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠HYP、GSH、T-AOC的比較(ˉx±s,n=10)

2.3 免疫組化檢測TNF-α、IL-1β、iNOS蛋白水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，模型組肺組織TNF-α、IL-1β、iNOS蛋白含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，紫檀芪組和強的松組肺組織TNF-α、IL-1β、iNOS蛋白含量明顯減少（P＜0.01）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠IL-1β、iNOS、TNF-α蛋白表達(dá)（免疫組化×200）

表3 各組IL-1β、iNOS、TNF-α蛋白表達(dá)水平的比較(IOD;±s,n=10)

表3 各組IL-1β、iNOS、TNF-α蛋白表達(dá)水平的比較(IOD;±s,n=10)

與正常對照組比較,**P＜0.01；與模型組比較,##P＜0.01

組別正常對照組模型組強的松組紫檀芪組IL-1β 946.59±90.32 12 005.14±952.63**3 814.79±312.31##2 096.04±205.61##iNOS 520.44±55.86 10 276.18±829.64**4 447.40±801.78##1 766.00±69.51##TNF-α 1 586.49±133.39 17 733.01±3 001.90**3 920.35±283.85##2 392.72±453.26##

2.4 紫檀芪對肺纖維化大鼠肺組織TLR4、NFκB p65蛋白表達(dá)的影響與正常對照組相比，模型組TLR4、NF-κB p65磷酸化水平升高（P＜0.01）；但經(jīng)紫檀芪及強的松治療后，TLR4、NF-κB p65磷酸化水平下調(diào)，與模型組比較，差異均有顯著性（P＜0.05）。見表4、圖3。

表4 各組大鼠肺組織中TLR4、NF-κB p65蛋白相對表達(dá)水平的比較(ˉx±s,n=10)

圖3 各組大鼠肺組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)結(jié)果

2.5 RT-PCR檢測TLR4、NF-κB p65的m RNA表達(dá)水平與正常對照組相比，模型組肺組織中TLR4、NF-κB p65 mRNA均升高（P＜0.01）；紫檀芪組及強的松組TLR4、NF-κB p65 mRNA均低于模型組（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組大鼠肺組織中TLR4、NF-κB p65 mRNA的比較

3 討論

肺纖維化表現(xiàn)為肺組織慢性炎癥和纖維化，博來霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化在病理組織學(xué)改變及肺功能等方面與人肺纖維化最為相近，是目前應(yīng)用最為廣泛的動物模型［6］。本課題組大鼠肺纖維化造模已非常成熟，氣管內(nèi)注入鹽酸博來霉素可導(dǎo)致大量的膠原纖維在支氣管和肺門附近沉積，病理結(jié)果顯示各給藥組肺組織膠原沉積程度和范圍明顯減小，肺纖維化程度顯著減輕，提示紫檀芪有一定改善大鼠肺纖維化癥狀的作用。肺纖維化的特征表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)在肺組織內(nèi)過多沉積，分泌大量膠原蛋白成分，肺間質(zhì)膠原明顯增加，而羥脯氨酸為膠原纖維所特有，HYP含量測定可反映肺組織中膠原含量的變化，是肺纖維化程度的重要標(biāo)志。本實驗中模型組肺組織HYP的含量大幅上升，而紫檀芪組HYP含量顯著降低，表明紫檀芪對肺纖維化進程中HYP的產(chǎn)生具有抑制作用，改善膠原蛋白的積聚，減輕肺纖維化。

TLR4是一種膜識別受體，通過激活NF-κB通路及誘導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)，在細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、自噬的發(fā)生、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等方面有重要作用［7］。TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可啟動下游的NF-κB通路，從而刺激機體釋放炎癥因子。NF-κB在體內(nèi)參與了各種促炎因子、趨化因子等相關(guān)下游因子的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控，在炎癥和纖維化中發(fā)揮重要作用，因此阻斷NF-κB轉(zhuǎn)錄活性可能是治療炎癥性疾病的重要靶點［8］。在生理狀況下NF-κB與IκB結(jié)合處于被抑制狀態(tài)，TLR4被激活后，通過一系列級聯(lián)反應(yīng)激活上游抑制蛋白IκB等，使其磷酸化降解，繼而激活NF-κB p65由細(xì)胞質(zhì)移位至細(xì)胞核，與靶序列和促炎基因的啟動子結(jié)合，通過上調(diào)或下調(diào)各種參與炎癥反應(yīng)過程的介質(zhì)，例如NO、TNF-α、IL-1β、iNOS等的釋放，來影響炎癥的發(fā)生發(fā)展［9］。iNOS是炎癥免疫反應(yīng)主要的限速酶［10］，炎性因子和氧化應(yīng)激等刺激下活化的iNOS可產(chǎn)生大量的NO，加劇組織損傷；NF-κB信號通路是炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的主要通路之一，NF-κB的活化可進一步激活iNOS等，使炎癥反應(yīng)得以級聯(lián)放大。TNF-α是具有促炎作用的關(guān)鍵炎性因子，其基因轉(zhuǎn)錄啟動區(qū)或增強子上有NF-κB的結(jié)合位點，主要通過NF-κB途徑發(fā)揮作用，兩者相互促進，共同調(diào)控肺纖維化的發(fā)展［11］。本次研究中，與正常對照組相比，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β、iNOS、TLR4和NF-κB p65的磷酸化水平明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，紫檀芪組大鼠肺組織中TLR4和NF-κB p65的蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)，紫檀芪能顯著降低模型大鼠肺組織IL-1β、TNF-α、iNOS等炎癥因子分泌水平，表明紫檀芪可能在肺纖維化的炎癥反應(yīng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，能減輕肺纖維化的炎癥反應(yīng)。

氧化應(yīng)激在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中越來越受到重視，細(xì)胞因子如TNF-α、IL-4、IL-10、IL-1β等與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，可調(diào)節(jié)氧化/抗氧化系統(tǒng)之間平衡，減少氧化應(yīng)激損傷［12］。氣管內(nèi)注入的博來霉素可產(chǎn)生活性氧致肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，破壞機體氧化應(yīng)激水平，如體內(nèi)重要的抗氧化劑GSH和T-AOC水平會大幅下降（GSH、T-AOC水平反映了人體清除自由基的抗氧化能力）。本次研究發(fā)現(xiàn)，模型組與正常對照組相比，氧化應(yīng)激指標(biāo)GSH、T-AOC降低，經(jīng)過紫檀芪干預(yù)后，GSH、TAOC水平有明顯升高，表明紫檀芪能提高肺纖維化大鼠的抗氧化能力，降低氧化損傷。

綜上所述，紫檀芪可能通過阻斷TLR4/NF-κB信號通路進而抑制炎癥因子表達(dá)，改善氧化應(yīng)激水平，減輕肺組織損傷和肺纖維化進程，該結(jié)果為紫檀芪作為肺纖維化的潛在治療藥物提供了新的證據(jù)。