范家萌，王至嚴，林慧慧，周桂林，王浩波

(合肥豐樂種業(yè)股份有限公司，農(nóng)作物種子新技術(shù)與新品種創(chuàng)制安徽省重點實驗室，安徽合肥 230088)

品種純度是衡量種子質(zhì)量的重要指標，品種純度鑒定包括田間鑒定和室內(nèi)鑒定2種方法。田間鑒定是在作物生育期間，結(jié)合檢查病蟲雜草以及田間生育狀況和倒伏情況對田間進行品種純度檢驗，耗時費力。室內(nèi)純度鑒定目前主要是SSR分子標記鑒定。SSR分子標記技術(shù)是一種基于擴增PCR和微衛(wèi)星定位的DNA特性的標記技術(shù)，微衛(wèi)星DNA的長度呈現(xiàn)高度變異，但是其兩側(cè)的堿基序列高度保守，因此可以根據(jù)保守序列，設(shè)計引物對DNA進行PCR擴增，通過擴增產(chǎn)物的長度多態(tài)性，揭示不同的個體或品種間的遺傳差異。該技術(shù)一直以高效、準確可靠、不受環(huán)境影響等優(yōu)勢而得到廣泛應(yīng)用。

分子標記鑒定的效率和成本主要取決于PCR產(chǎn)物電泳所用儀器及電泳方法。目前分子標記鑒定技術(shù)中電泳分析環(huán)節(jié)包括3種途徑：①聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)；②ZAG單色毛細管電泳儀電泳；③DNA分析儀的熒光電泳。其中PAGE操作復(fù)雜、分辨率不高、效率低；在試驗操作過程中會有試劑污染，對實驗員及實驗室安全衛(wèi)生都有不同程度的影響。DNA分析儀的熒光電泳由于儀器和試劑價格昂貴，運行成本高，在商業(yè)化應(yīng)用中受到極大限制。ZAG單色毛細管電泳儀以進樣量少、分析速度快、分離效率高、有機溶劑少、自動化程度高等特點被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、高分子等領(lǐng)域，但由于是單色熒光顯色，試劑耗材依靠廠家提供，造成單重電泳的使用成本偏高。筆者擬采用混合不同片段大小的PCR產(chǎn)物進行多重電泳，以提高試劑耗材的利用率，進一步提升ZAG單色毛細管電泳儀的使用效能。

1 材料與方法

試驗品種。隨機選用合肥豐樂種業(yè)股份有限公司2021年生產(chǎn)的雜交水稻品種豐兩優(yōu)3305與常規(guī)稻品種潤稻118。

試劑來源。PCR反應(yīng)所用Buffer、DNTP等試劑購于上海生工生物工程有限公司，引物合成于安徽通用生物科技有限公司，酶購于艾科瑞生物科技有限公司，試驗耗材購于合肥舜田實驗部。

主要儀器設(shè)備。T100型梯度PCR儀，美國伯樂(Bio-Rad Laboratories，Inc.)公司；Nanodrop 2000C 型核酸蛋白分析儀，美國熱電公司；ZAG-Z7576毛細管電泳儀，Agilent公司生產(chǎn)。

DNA快速提取及質(zhì)量檢測。每個品種隨機取96株幼苗，每株幼苗取0.8 cm×0.8 cm大小的樣品，放入PCR板中，加入0.25 mol/L NaOH溶液20 μL，放進水浴鍋中99 ℃煮2 min，然后加入0.25 mol/L Tris-HCl溶液30 μL后冷卻。用核酸蛋白分析儀檢測DNA的濃度和質(zhì)量，DNA濃度在15～50 ng/μL，DNA質(zhì)量在1.8～2.0。

PCR反應(yīng)體系及擴增程序。PCR反應(yīng)體系(10 μL)：DNA模板2.0 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，ddHO 4.5 μL，PCR Master Mix 2.5 μL。PCR擴增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；然后每個循環(huán)變性：94 ℃15 s，退火55 ℃30 s，延伸72 ℃ 30 s。循環(huán)次數(shù)32次，72 ℃保溫10 min。

SSR分子標記引物選擇。根據(jù)GB/T 39917—2021《主要農(nóng)作物真實性和純度SSR分子標記檢測 稻》中推薦的8對候選引物，參照豐兩優(yōu)3305的指紋圖譜，找到豐兩優(yōu)3305雙親帶型有差異的引物，分別是RM336、RM208、RM224、RM8277、RM19，在RM19標記位點上的指紋是245/251，父母本差異偏小，排除該標記位點，用RM224、RM8277、RM336、RM208進行純度鑒定并組合雙重電泳。根據(jù)潤稻118品種的SSR分子標記上的帶型，選擇多態(tài)性較好且產(chǎn)物片段大小差異較大的3個引物RM224、RM8277、RM19進行SSR分子標記純度鑒定(表1)。

毛細管電泳。

普通單重毛細管電泳。將96孔PCR產(chǎn)物加buffer定容至25 μL，打開ZAG軟件后，選擇樣品托盤Sample tray→ 添加托盤Add tray to queue → 選擇跑膠模式(1板費膠模式+8板省膠模式)→ 點擊Edit更改電泳參數(shù)，一般設(shè)置電壓4～5 kV，室溫高于25 ℃時，每板電泳時間在50 min左右，溫度越低，電泳時間越長。更改參數(shù)后之后點擊OK，在待電泳界面點擊綠色運行標識即可進行電泳。

多重毛細管電泳。擴增產(chǎn)物采用單色ZAG-Z7576毛細管電泳儀。將2～3個不同引物的PCR擴增產(chǎn)物混合，每個擴增產(chǎn)物取5 μL至新的96孔PCR擴增板，然后加雙蒸水定容至25 μL。軟件及儀器操作步驟與單重毛細管電泳一致。

表1 水稻純度鑒定SSR分子標記

純度統(tǒng)計。

樣品純度=(供檢株數(shù)-雜株數(shù))/供檢株數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

豐兩優(yōu)3305在RM224標記位點上的純度檢測結(jié)果見圖1，1 bp和500 bp處是試劑盒Marker的范圍，即PCR產(chǎn)物片段在1～500 bp。豐兩優(yōu)3305在RM224標記位點的片段是159(母本帶)/185(父本帶)(表1)。H2孔沒有擴增產(chǎn)物，記為空，供檢株數(shù)94株，A8孔的帶型是母本帶159和非父本帶196；H6孔是僅一條母本帶159，H12孔是標尺(圖1)。

圖1 豐兩優(yōu)3305在RM224 標記位點的帶型Fig.1 The band pattern of Fengliangyou 3305 at the RM224 marker

豐兩優(yōu)3305在RM8277標記位點上的純度檢測結(jié)果見圖2，Marker與圖1一致。該產(chǎn)物片段是220(父本帶)/234(母本帶)(表1)。A8和H2孔沒有產(chǎn)物，記為空，H12孔是標尺。供檢株數(shù)93株，所有單株的PCR產(chǎn)物帶型一致，沒有雜帶(圖2)。

豐兩優(yōu)3305在RM336標記位點上的純度檢測結(jié)果見圖3，產(chǎn)物片段是133(父本帶)/159(母本帶)(表1)。其中，A2、G1、G2、H4、H5共5個孔沒有擴增產(chǎn)物，記為空，供檢株數(shù)91株，A4和H1孔都是1條母本帶159，其他孔帶型一致。

豐兩優(yōu)3305在RM208標記位點上的純度檢測結(jié)果見圖4，產(chǎn)物片段是143(父本帶)/164(母本帶)(表1)。供檢株數(shù)96株，H7是一條母本帶164，其他孔帶型一致。

該試驗對豐兩優(yōu)3305在RM224、RM8277、RM336、RM208標記位點進行純度鑒定，鑒定結(jié)果匯總見表2。GB 4404.1—2008《糧食作物種子》標準中規(guī)定，水稻雜交種的大田用種純度不低于96.0%。由表2可知，4個標記位點的純度結(jié)果均高于標準值。

將豐兩優(yōu)3305的RM224和RM8277的PCR產(chǎn)物混勻到同一96孔板，加水至25 μL，雙重電泳結(jié)果見圖5。條帶159/185是RM224標記的產(chǎn)物片段，條帶220/234是RM8277標記的產(chǎn)物片段。和單重電泳結(jié)果比較，結(jié)果一致，且2個標記的產(chǎn)物之間沒有影響。

圖2 豐兩優(yōu)3305在RM8277標記位點的帶型Fig.2 The band pattern of Fengliangyou 3305 at the RM8277 marker

圖3 豐兩優(yōu)3305在RM336標記位點的帶型Fig.3 The band pattern of Fengliangyou 3305 at the RM336 marker

圖4 豐兩優(yōu)3305在RM208標記位點的帶型Fig.4 The band pattern of Fengliangyou 3305 at the RM208 marker

表2 豐兩優(yōu)3305的SSR分子標記純度鑒定結(jié)果

將豐兩優(yōu)3305的RM336、RM208的產(chǎn)物PCR產(chǎn)物混勻到同一96孔板，加水至25 μL后混合進行雙重電泳。條帶133/159是RM336標記的產(chǎn)物片段，條帶143/164是RM208標記的產(chǎn)物片段。如圖6所示，133和143兩個片段可以區(qū)分，而159和164兩個片段相差5 bp，帶型有重合，無法判讀結(jié)果。

圖5 豐兩優(yōu)3305在RM224、RM8277標記位點的雙重電泳Fig.5 Double electrophoresis of Fengliangyou 3305 at the marked sites of RM224 and RM8277

圖6 豐兩優(yōu)3305在RM336、RM208標記位點的雙重電泳Fig.6 Double electrophoresis of Fengliangyou 3305 at the marked sites of RM336 and RM208

根據(jù)豐兩優(yōu)3305雙重電泳結(jié)果可知，不同引物的產(chǎn)物片段差異超過10 bp可以進行混合電泳，產(chǎn)物之間沒有影響，與單重電泳結(jié)果一致。潤稻118純度檢測RM224、RM8277、RM19的片段大小分別是132/132、147/147、201/201，之間相差均在10 bp以上，產(chǎn)物可以混合電泳。3個標記產(chǎn)物多重電泳結(jié)果見圖7。在RM224標記位點上，F(xiàn)8沒有擴增產(chǎn)物，記為空，供檢株數(shù)94株，其他帶型一致沒有雜帶；在RM8277標記位點上沒有雜帶和空孔；在RM19標記位點上，H11孔顯示是雜帶，其他帶型一致。由表3可知，在RM224、RM8277、RM19標記位點上，潤稻118的純度分別為100%、100%、98.9%。

圖7 潤稻118在RM224、RM8277、RM19標記位點的三重電泳Fig.7 Triple electrophoresis of Rundao 118 at marker sites of RM224，RM8277 and RM19

3 結(jié)論與討論

該試驗選用豐樂水稻雜交品種豐兩優(yōu)3305和常規(guī)稻品種潤稻118的不同引物進行單重和多重電泳比對。結(jié)果表明，相差10 bp以上的PCR產(chǎn)物混合兩重和三重電泳，對檢測結(jié)果沒有影響。該試驗在鑒定水稻雜交品種純度時，結(jié)合實際選用2個分子標記進行試驗。今后在分子標記純度鑒定中可以根據(jù)需要混合更多引物，驗證雜交種更多重的毛細管電泳效果。

根據(jù)SSR分子標記純度鑒定結(jié)果可以看出，同一品種在不同標記位點上的純度結(jié)果不同，如豐兩優(yōu)3305品種在RM224標記位點上純度結(jié)果是97.9%，在RM8277標記位點上是100%?？赡苁窃撈贩N的父母本在RM224標記位點上輕微分離造成的。通過分子標記和田間純度鑒定結(jié)果比較分析，父母本在某個位點輕微分離，但不會造成品種表現(xiàn)型的變化，分子標記純度鑒定時應(yīng)排除該標記位點。

表3 潤稻118的純度鑒定結(jié)果

該試驗研究的多重毛細管電泳檢測技術(shù)，通過不同標記的產(chǎn)物進行混合多重電泳，即混合不同大小的DNA片段在一個毛細管上進行電泳，混合3個PCR產(chǎn)物成本可以從2～3元降低到0.7～1.0元，相應(yīng)的電泳時間也縮短了2倍，多重毛細管電泳既降低檢測成本又提高試驗效率，進一步提升了毛細管電泳使用效能，為分子標記鑒定技術(shù)更廣泛的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

安徽省地方標準DB 34/T 3308—2018《兩系雜交水稻種子純度檢測 分子標記法》規(guī)范了兩系水稻分子純度檢測的流程，針對的是PAGE電泳方法。國家標準GB/T 39917—2021《主要農(nóng)作物真實性和純度SSR分子標記檢測 稻》，該標準的純度檢測毛細管電泳部分主要是針對DNA分析儀的多色熒光毛細管電泳技術(shù)。該試驗研究一種混合單色多重PCR產(chǎn)物的電泳技術(shù)，綜合了PAGE電泳與DNA分析儀的優(yōu)點，既可以克服單重電泳成本高的問題，又進一步規(guī)范毛細管電泳的技術(shù)流程和操作細節(jié)，保證試驗結(jié)果的穩(wěn)定性。