張明昊，俎兆軒，張 童，郭 申，杜婧雯，趙 紳（河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046）

腎纖維化（renal fibrosis，RF）是原發(fā)或繼發(fā)慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）發(fā)展至終末期腎衰竭的共同病理途徑，以腎小管萎縮、腎小球硬化為主要特征[1－2]。當(dāng)腎臟組織受損后，腎間質(zhì)會出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞也會凋亡，而來源于腎小管上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transdifferentiation，EMT）的肌成纖維細(xì)胞將會聚集并使細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的生成與降解失衡，從而導(dǎo)致ECM過度沉積，進(jìn)而引發(fā)RF[3－4]。西醫(yī)治療RF主要為對癥治療，即控制血壓、血糖、血脂水平及抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)，以達(dá)到控制原發(fā)病和防治并發(fā)癥的目的[5]，但難以逆轉(zhuǎn)RF過程。

中醫(yī)學(xué)將CKD歸屬為“水腫、虛勞、癃閉、關(guān)格”范疇。CKD遷延日久，或失治誤治，即進(jìn)展成RF，故RF病機(jī)多為本虛標(biāo)實——以脾腎虛損為本虛，以濁毒、濕熱、瘀血為標(biāo)實，故中醫(yī)治療當(dāng)以補氣、溫陽、滋陰養(yǎng)血為主[6]。金匱腎氣丸出自《金匱要略》，有“千古補腎之組方”之稱，可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、清除氧自由基、抗氧化、抗纖維化，且效果顯著[7]?？紤]到金匱腎氣丸補益腎氣的作用符合RF的中醫(yī)治療思路，因此本研究選用金匱腎氣丸對RF模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，以秋水仙堿為陽性對照藥物，觀察金匱腎氣丸對RF模型大鼠腎功能、病理學(xué)形態(tài)及纖維化的影響。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，金匱腎氣丸可通過抑制單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）模型大鼠α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表達(dá)，改善腎功能；還可通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的活性、升高基質(zhì)金屬蛋白酶的活性來減少腎間質(zhì)膠原物質(zhì)的沉積[8]，而基質(zhì)金屬蛋白酶系的活性調(diào)節(jié)均與轉(zhuǎn)化生長因子 β1（transforming growth factor，TGF-β1）有關(guān)。TGF-β1是目前公認(rèn)的致纖維化因子之一，可增加ECM合成并抑制其降解，使腎臟細(xì)胞與基質(zhì)的黏附增加，從而導(dǎo)致腎臟固有細(xì)胞凋亡及炎癥細(xì)胞浸潤。TGF-β1主要通過Smad依賴及非依賴的胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated protein kinases，ERK）通路這2個途徑協(xié)同誘導(dǎo)RF過程[9]，而抑制TGF-β1及其介導(dǎo)的信號通路就可以延緩甚至逆轉(zhuǎn)RF過程。基于以上研究基礎(chǔ)，考慮到中藥具有作用于多靶點和通路的特點，本研究將通過TGF-β1/Smads和TGF-β1/ERK這2條信號通路來探討金匱腎氣丸對RF模型大鼠的干預(yù)作用及機(jī)制，以期為金匱腎氣丸治療RF提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有BS110S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司），MR-96TB型酶標(biāo)儀[騁克儀器（上海）有限公司]，RM2235型石蠟切片機(jī)（德國Leica公司），D3024R型臺式高速冷凍型微量離心機(jī)[大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司]，YD-6D型組織包埋機(jī)、YD-A型組織攤片機(jī)、YD-B型組織烤片機(jī)（金華市科迪儀器設(shè)備有限公司），CX23型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），Stepone plus型熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（美國ABI公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有金匱腎氣丸（北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號19032632，規(guī)格0.2 g/粒），秋水仙堿片（西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號190704，規(guī)格0.5 mg/片），羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20160704），氨基甲酸乙酯（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，批號20210902），腺嘌呤、蘇木素染色液、伊紅染色液（福州飛凈生物科技有限公司，批號分別為PH1779、190805、20211009），肌酐（creatinine，Cr）檢測試劑盒、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批號分別為C011-1-1、C013-1-1），兔SP試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號分別為SP-9001、ZLI-9018），兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體、兔抗大鼠Smad2多克隆抗體、兔抗大鼠Smad3多克隆抗體、兔抗大鼠ERK1多克隆抗體、兔抗大鼠ERK2多克隆抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號分別為 GB11179、GB11511、GB111844、GB13003、GB11370-1）；其余試劑為實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 動物

本研究所用動物為健康SD雄性大鼠，8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購自鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實驗動物養(yǎng)殖場，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（豫）2019-0002。實驗期間動物飼養(yǎng)室環(huán)境溫度為20～22℃，相對濕度為55%～60%，正常光照，大鼠自由飲水采食。本研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號為DWLL20180018），實驗過程及動物處置嚴(yán)格遵守“3R”原則。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

取雄性SD大鼠53只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按250 mg/kg灌胃腺嘌呤混懸液（以0.1%CMC-Na溶液溶解），每天1次，連續(xù)15 d；然后改為隔日1次，連續(xù)15 d。第31天隨機(jī)取3只大鼠腹腔注射1 g/kg氨基甲酸乙酯麻醉，取腹主動脈血檢測Cr、BUN水平，并剖取腎臟做常規(guī)病理檢查。若大鼠血清中Cr、BUN水平升高，且顯微鏡下腎組織的纖維化及炎癥細(xì)胞浸潤明顯，則提示RF模型構(gòu)建成功[4]。將50只造模成功的大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、秋水仙堿片組和金匱腎氣丸低、中、高劑量組，每組10只；另取10只未造模大鼠作為正常組。金匱腎氣丸、秋水仙堿片的人口服劑量分別為每天10 g、5 mg，經(jīng)折算后，得金匱腎氣丸、秋水仙堿片在大鼠中的用量分別為1 g/kg、0.45 mg/kg。基于此，本實驗以折算劑量1 g/kg為金匱腎氣丸中劑量；以0.5、2 g/kg（折算劑量的1/2、2倍）為金匱腎氣丸低、高劑量；以0.45 mg/kg為秋水仙堿片劑量。以上藥物均灌胃給藥，灌胃體積為10 mL/kg；正常組和模型組大鼠灌胃等體積0.1%CMCNa溶液，每天1次，連續(xù)30 d。

2.2 取材及處理

末次灌胃24 h后，各組大鼠稱質(zhì)量后腹腔注射1 g/kg氨基甲酸乙酯麻醉，取腹主動脈血，以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液于－80℃條件下儲存。剖取腎臟，去除腎臟周圍結(jié)締組織，以生理鹽水洗滌，觀察腎臟外觀形態(tài)，用濾紙吸盡腎臟表面液體后使用電子天平稱量；然后將腎臟組織一分為二，其中一份用4%多聚甲醛固定，另一份用液氮速凍后于－80℃條件下保存。

2.3 大鼠血清中Cr、BUN水平的檢測

取“2.2”項下血清樣品，采用分光光度法檢測各組大鼠血清中Cr、BUN的水平，并計算BUN/Cr的比值以評價腎臟功能。

2.4 大鼠腎臟系數(shù)的檢測

統(tǒng)計大鼠體質(zhì)量與腎臟質(zhì)量，計算腎臟系數(shù)（腎臟系數(shù)＝腎臟質(zhì)量/體質(zhì)量），以此來評價腎臟的病變程度。

2.5 大鼠腎臟組織的病理形態(tài)學(xué)觀察

取4%多聚甲醛固定的腎臟組織適量，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（厚度為4 μm）等過程制作病理切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，一部分切片經(jīng)蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理學(xué)變化。一部分切片（剩余部分用于后續(xù)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測）經(jīng)Masson染色（其中肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)綠色），于光學(xué)顯微鏡（×400）下隨機(jī)選取1個視野，以藍(lán)綠色為陽性染色，采用Image-Pro Plus 6.0軟件測定每個視野下藍(lán)綠色陽性面積與總面積，計算陽性面積百分比。

2.6 大鼠腎臟組織中TGF-β1介導(dǎo)的Smads和ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測

采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行檢測。取“2.5”項下石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、水化后，以H2O2封閉，再以磷酸鹽緩沖液清洗，檸檬酸鹽緩沖液熱修復(fù)8 min；滴加山羊血清封閉液，室溫孵育30 min，傾去液體，分別滴加TGF-β1、Smad2、Smad3、ERK1、ERK2一抗（稀釋度均為1∶200），4℃孵育過夜；滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃孵育20 min，DAB顯色10 min，用自來水沖洗后，經(jīng)蘇木素復(fù)染3 min，用鹽酸乙醇分化，并用自來水再次沖洗；切片經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后，采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。每只大鼠腎臟切片在光學(xué)顯微鏡（×400）下隨機(jī)選取1個視野，以棕黃色為陽性染色，采用Image-Pro Plus 6.0軟件測定每個視野中陽性染色區(qū)域的積分光密度（integrated optical density，IOD）值，用來反映目的蛋白的表達(dá)情況。

2.7 大鼠腎臟組織中TGF-β1介導(dǎo)的Smads和ERK通路相關(guān)mRNA表達(dá)水平的檢測

采用實時熒光定量PCR法進(jìn)行檢測。根據(jù)GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）已發(fā)表的大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3、ERK1、ERK2 基因序列設(shè)計特異性引物（引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1），以上引物由武漢塞維爾生物科技有限公司合成。取腎臟組織100 mg，加入1 mL TriQuick試劑充分研磨勻漿后提取總RNA，檢測RNA濃度及純度。取總RNA適量，在20 μL反應(yīng)體系中合成cDNA，再以2 μL cDNA為模板，加入靶基因的上、下游引物于15 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線及溶解曲線判斷PCR反應(yīng)的特異性。所得結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)水平。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗結(jié)果滿足正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠腎臟外觀形態(tài)的觀察結(jié)果

正常組大鼠腎臟形態(tài)完整，色澤紅潤且表面光滑。模型組大鼠腎臟體積明顯增大，表面顆?；瘒?yán)重，顏色灰白且缺血；剖開后可見腎內(nèi)有大量積液潴留，腎皮質(zhì)明顯變薄，皮髓質(zhì)界限不清晰。秋水仙堿片組和金匱腎氣丸各劑量組大鼠腎臟表面色澤較模型組稍顯紅潤，但仍呈缺血狀態(tài)，表面顆?；潭雀纳撇幻黠@（圖略）。

3.2 大鼠血清中Cr、BUN水平及BUN/Cr比值的測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中Cr、BUN水平均顯著升高（P＜0.05），BUN/Cr比值顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，秋水仙堿片組和金匱腎氣丸各劑量組大鼠血清中Cr、BUN水平均顯著降低（P＜0.05），BUN/Cr比值均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清中Cr、BUN水平及BUN/Cr的測定結(jié)果（±s，n＝10）

表2 各組大鼠血清中Cr、BUN水平及BUN/Cr的測定結(jié)果（±s，n＝10）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組秋水仙堿片組金匱腎氣丸低劑量組金匱腎氣丸中劑量組金匱腎氣丸高劑量組BUN/Cr 40.82±8.68 20.59±3.78a 33.85±7.09b 35.75±7.31b 33.79±6.23b 44.70±8.54b Cr/（μmol/L）240.49±33.38 646.59±75.37a 169.47±36.30b 313.98±61.35b 271.17±40.17b 261.68±19.78b BUN/（mmol/L）39.35±4.88 53.98±8.59a 45.31±2.62b 49.66±6.43b 39.58±5.73b 47.15±8.79b

3.3 大鼠腎臟系數(shù)的測定結(jié)果

正常組、模型組、秋水仙堿片組和金匱腎氣丸低、中、高劑量組大鼠腎臟系數(shù)分別為（6.89±0.28）×10－3、（37.16±5.61）×10－3、（20.77±2.62）×10－3、（33.59±7.31）×10－3、（29.11±5.12）×10－3、（22.30±3.72）×10－3。與正常組比較，模型組大鼠腎臟系數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，秋水仙堿片組和金匱腎氣丸中、高劑量組大鼠腎臟系數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。

3.4 大鼠腎臟組織病理形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠腎小球形態(tài)規(guī)則，腎小管結(jié)構(gòu)排列整齊，無系膜增生，間質(zhì)正常，未見炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠可見系膜增生，腎小管擴(kuò)張或萎縮，腎小球硬化且形態(tài)不規(guī)則，可見炎癥細(xì)胞浸潤；秋水仙堿片組和金匱腎氣丸各劑量組大鼠腎小管擴(kuò)張或萎縮較模型組減輕，炎癥細(xì)胞減少，病變減輕。Masson染色結(jié)果顯示，正常組大鼠腎臟組織僅有少量膠原蛋白沉積；模型組大鼠腎臟組織有大面積膠原蛋白沉積；秋水仙堿片組和金匱腎氣丸各劑量組大鼠腎臟組織中膠原蛋白沉積較模型組均不同程度地減少。正常組、模型組、秋水仙堿片組和金匱腎氣丸低、中、高劑量組大鼠腎臟組織Masson染色陽性面積百分比分別為（15.20±0.71）%、（39.40±0.83）%、（17.40±0.43）%、（16.33±0.93）%、（14.82±0.86）%、（12.81±0.58）%。與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織Masson染色陽性面積百分比顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，秋水仙堿片組和金匱腎氣丸各劑量組該百分比則顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織的病理形態(tài)學(xué)顯微圖（×400）

3.5 大鼠腎臟組織中TGF-β1介導(dǎo)的Smads和ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果

正常組大鼠腎臟組織中有少量TGF-β1、Smad2、Smad3、ERK1、ERK2蛋白表達(dá)；與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織中有大量上述5種蛋白表達(dá)，其陽性表達(dá)的IOD值均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，秋水仙堿片組和金匱腎氣丸各劑量組大鼠腎臟組織中有少量上述5種蛋白表達(dá)，其陽性表達(dá)的IOD值顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖2、表3。

表3 各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、ERK1、ERK2蛋白陽性染色的IOD值測定結(jié)果（±s，n＝10，×103）

表3 各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、ERK1、ERK2蛋白陽性染色的IOD值測定結(jié)果（±s，n＝10，×103）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組秋水仙堿片組金匱腎氣丸低劑量組金匱腎氣丸中劑量組金匱腎氣丸高劑量組Smad2蛋白164.50±3.35 506.78±1.77a 126.33±0.74b 205.43±1.90b 195.03±2.80b 143.82±1.59b ERK2蛋白107.38±2.21 335.40±2.61a 104.12±2.11b 155.08±2.44b 134.55±2.90b 146.46±2.28b TGF-β1蛋白187.06±2.10 485.23±2.42a 154.74±2.31b 276.92±1.40b 205.30±3.19b 144.25±2.23b Smad3蛋白105.35±2.76 454.64±2.92a 104.08±3.13b 225.33±2.10b 204.89±2.70b 104.91±2.88b ERK1蛋白155.48±2.03 538.14±1.82a 103.63±1.66b 175.59±2.45b 176.95±2.52b 174.72±2.67b

圖2 各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、ERK1、ERK2蛋白表達(dá)的免疫組化顯微圖（×400）

續(xù)圖2

3.6 大鼠腎臟組織中TGF-β1介導(dǎo)的Smads和ERK通路相關(guān)mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，秋水仙堿片組和金匱腎氣丸各劑量組大鼠腎臟組織中上述5種mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4 各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)水平的測定結(jié)果（±s，n＝10）

表4 各組大鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、ERK1、ERK2 mRNA表達(dá)水平的測定結(jié)果（±s，n＝10）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組秋水仙堿片組金匱腎氣丸低劑量組金匱腎氣丸中劑量組金匱腎氣丸高劑量組ERK2/GAPDH 1.00±0.00 2.39±0.50a 1.23±0.12b 1.87±0.11b 1.53±0.22b 1.39±0.15b TGF-β1/GAPDH 1.00±0.00 23.52±0.68a 13.23±2.90b 20.92±1.24b 15.71±2.68b 13.89±1.55b Smad2/GAPDH 1.00±0.00 33.15±1.79a 13.27±5.56b 29.37±0.82b 23.67±2.12b 23.68±1.90b Smad3/GAPDH 1.00±0.00 37.68±6.03a 11.14±4.00b 26.62±0.81b 22.97±1.68b 22.02±3.23b ERK1/GAPDH 1.00±0.00 8.51±2.35a 3.63±1.05b 6.49±0.27b 5.91±0.67b 5.59±0.36b

4 討論

RF是CKD發(fā)展至終末期的最終表現(xiàn)，其動物模型可由藥物、手術(shù)及轉(zhuǎn)基因等方法誘導(dǎo)構(gòu)建，以UUO模型和腺嘌呤誘導(dǎo)的模型最為經(jīng)典[10]。UUO模型是采用手術(shù)方式結(jié)扎輸尿管，引發(fā)尿潴留、腎腫大以及腎小管細(xì)胞壞死，從而導(dǎo)致腎功能喪失；該模型可模擬因尿路梗阻導(dǎo)致RF的進(jìn)程，但病變往往只發(fā)生于結(jié)扎一側(cè)，另一側(cè)腎可彌補梗阻腎的功能[10]。腺嘌呤是嘌呤類含氮雜環(huán)化合物，可在黃嘌呤氧化酶的作用下代謝為2，8-二羥基腺嘌呤并積聚于腎小管，形成晶體堵塞腎小管，阻止氮質(zhì)化合物排出，使血清中Cr、BUN、尿酸等指標(biāo)的水平升高，大量過飽和的尿酸會在血液中結(jié)晶并沉積于腎小管、間質(zhì)及腎小球部位，從而使腎臟局部發(fā)生肉芽腫性炎癥和腎單位損傷，這一過程還與TGF-β密切相關(guān)[11]。故本實驗采用腺嘌呤誘導(dǎo)構(gòu)建大鼠RF模型。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RF模型大鼠血清中Cr、BUN水平升高，BUN/Cr值降低，腎臟外表面顏色灰白且呈顆粒化，腎小管出現(xiàn)不同程度擴(kuò)張或萎縮，間質(zhì)增寬且纖維化組織增多，這表明造模成功。

RF是CKD患者腎功能喪失的主要原因，以激素、干擾素、血管緊張素酶抑制劑為主的西醫(yī)治療手段療效有限，難以逆轉(zhuǎn)RF進(jìn)程。中醫(yī)藥或中西醫(yī)結(jié)合治療有望為延緩甚至逆轉(zhuǎn)RF進(jìn)展提供新的思路。中醫(yī)理論認(rèn)為，慢性腎衰與脾腎有關(guān)，該病早中期多見脾腎氣虛，隨著病情加重，會逐步出現(xiàn)腎虛氣化失司、脾虛水濕不運，濕濁日久即生毒成瘀，濁毒蓄積而不能排出即成RF，故從“濁、毒、虛、瘀”論治乃中醫(yī)治療RF之根本[6]。金匱腎氣丸是化氣行水、溫腎補陽的經(jīng)典名方，方中地黃、山藥、酒萸肉滋陰補腎，陰中補陽，健脾固腎益精；附子、桂枝溫補陽氣、引火歸原；牛膝補肝腎，逐瘀通經(jīng)；茯苓、澤瀉、鹽車前子利尿通淋、活血通絡(luò)；牡丹皮清肝膽相火；諸藥并用，可補益腎中真陰真陽，致腎氣充盈，腎病消除[12]，故本實驗選擇金匱腎氣丸為RF的干預(yù)藥物加以研究。秋水仙堿是一種微管解聚劑，可以通過破壞細(xì)胞骨架完整性、抑制炎癥細(xì)胞浸潤、下調(diào)TGF-β等途徑來發(fā)揮抗RF的作用[13]，故本實驗選擇秋水仙堿片為陽性對照藥物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金匱腎氣丸能顯著降低RF模型大鼠血清中Cr、BUN水平，改善腎組織纖維化病變程度，對RF模型大鼠具有較好的干預(yù)作用。

TGF-β是一種多肽類細(xì)胞因子，有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3共3個亞型，所有亞型均含有7個Cys殘基，其中6個Cys殘基以鏈內(nèi)二硫鍵連接數(shù)個β折疊片，以形成剛性結(jié)構(gòu)；第7個Cys殘基則與另一分子的Cys殘基以鏈間二硫鍵形式連接，以構(gòu)成具有生物活性的二聚體[14]。TGF-β在正常腎臟中幾乎無表達(dá)，病變時則高表達(dá)于腎小球與腎小管細(xì)胞中，其中以TGF-β1表達(dá)水平最高，可致ECM過度積聚，是RF形成過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[15]。Smad蛋白由氨基端的MH1結(jié)構(gòu)域、羧基端的MH2結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸的連接區(qū)組成，MH1與MH2這2個區(qū)域相互接觸，使Smad分子呈現(xiàn)無活性的分子折疊狀態(tài)；一旦被激活，Smad分子結(jié)構(gòu)就會打開形成低聚體復(fù)合物，轉(zhuǎn)移至核內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[16]。TGF-β1/Smads通路是絲氨酸/蘇氨酸激酶信號通路之一，通過受體偶聯(lián)發(fā)揮作用，即TGF-β1與細(xì)胞膜上受體TβRⅠ、TβRⅡ結(jié)合，形成TβRⅡ-TGF-β1-TβRⅠ三聚體，TβRⅡ可使TβRⅠ磷酸化，磷酸化的TβRⅠ又可通過磷酸化方式激活Smad2和Smad3；活化后的Smad2/3與Smad4形成異聚體進(jìn)入核內(nèi)，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)結(jié)締組織生長因子和Ⅰ型、Ⅲ型膠原基因過量表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT發(fā)生，增加ECM積聚，抑制ECM降解，形成RF[9]。ERK是絲裂原活化蛋白激酶家族成員之一，有ERK1和ERK2共2個亞型。TGF-β1/ERK通路是TGF-β1介導(dǎo)RF的又一重要通路，上述提到的TβRⅡ-TGF-β1-TβRⅠ三聚體經(jīng)活化后可使ShcA蛋白磷酸化，觸發(fā)生長因子受體結(jié)合蛋白2和SOS蛋白結(jié)合，激活Ras/ERK途徑并使ERK1/2磷酸化，進(jìn)而磷酸化多種底物蛋白，引起腎小管細(xì)胞膠原沉積，基底膜損傷，最終發(fā)生RF和腎小球硬化[17]。由TGF-β1介導(dǎo)的Smad2/3和ERK1/2通路存在相互作用，共同調(diào)控細(xì)胞凋亡和EMT過程。這一相互作用主要體現(xiàn)在Smad2/3連接子區(qū)域存在ERK磷酸化位點，這一區(qū)域的磷酸化可延長Smad2/3的轉(zhuǎn)錄活性持續(xù)時間以及半衰期，ERK1/2抑制劑可阻斷Smad2/3的磷酸化進(jìn)程；此外，Ras/ERK途徑還可擴(kuò)大TGF-β1反應(yīng)，并與TGF-β1協(xié)同誘導(dǎo)Smad依賴的Snail1表達(dá)，抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá)，促進(jìn)EMT的進(jìn)展[18]。本實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、ERK1、ERK2蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著升高，這提示TGF-β1介導(dǎo)的TGF-β1/Smads和TGF-β1/ERK這2條通路均被激活。經(jīng)金匱腎氣丸干預(yù)后，大鼠腎臟組織中上述蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著降低，表明金匱腎氣丸可通過抑制TGF-β1/Smads和TGF-β1/ERK這2條通路來發(fā)揮抗RF作用。

綜上所述，金匱腎氣丸可改善RF模型大鼠的腎臟功能，其作用機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smads和TGF-β1/ERK這2條信號通路有關(guān)。