董玲玲，張 璐，楊 星，龔旭昊，趙富華

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

馬波沙星(Marbofloxacin)，又叫麻保沙星，最早由瑞士羅氏公司研制，并于1995年先后在英法等國(guó)上市[1]，國(guó)內(nèi)獸藥生產(chǎn)企業(yè)自2014年起陸續(xù)申報(bào)馬波沙星原料及其制劑。馬波沙星是獸醫(yī)專(zhuān)用的第三代喹諾酮類(lèi)抗菌藥物，具有抗菌譜廣，消除半衰期長(zhǎng)，生物利用度高的特點(diǎn)，獸藥市場(chǎng)發(fā)展前景良好，但是國(guó)內(nèi)缺乏統(tǒng)一的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。為進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)獸藥安全性和有效性的控制，提高獸藥產(chǎn)品質(zhì)量，將研究制定馬波沙星原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)納入《中國(guó)獸藥典》2020年版科研任務(wù)。國(guó)內(nèi)能查到馬波沙星原料相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)5個(gè)，為申報(bào)企業(yè)的注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)[2-6]，歐洲藥典(EP 9.0)和英國(guó)藥典(BP 2017)也收載了馬波沙星原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[7]，對(duì)各質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，歐洲藥典和英國(guó)藥典收載的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相同，所有標(biāo)準(zhǔn)中吸光度、干燥失重、熾灼殘?jiān)?、重金屬、含量測(cè)定方法相同，其余項(xiàng)目存在差異。在文獻(xiàn)查閱的基礎(chǔ)上，著重研究有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑檢查和含量測(cè)定方法。最終建立的馬波沙星原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載入《中國(guó)獸藥典》2020年版一部[8]，內(nèi)容包括：性狀、鑒別(紫外光譜法和紅外光譜法)、吸光度、有關(guān)物質(zhì)、干燥失重、熾灼殘?jiān)?、重金屬、含量測(cè)定等項(xiàng)目。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(Waters e2489)配二極管陣列檢測(cè)器(2996)；瑞士萬(wàn)通全自動(dòng)滴定儀Titrando 809; AT201分析天平(Mettler Toledo); 色譜柱: Waters XTERRA RP18(4.6×150 mm,5 μm); Waters XBridge C18(4.6×150 mm, 5 μm); GRACE C18(4.6×150 mm,3 μm)。甲醇為色譜純，購(gòu)自Merck公司。辛烷磺酸鈉、磷酸二氫鈉均為分析純，購(gòu)自TCI公司。其余試劑均為分析純。馬波沙星原料6批，分別購(gòu)自浙江國(guó)邦藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)：160919；161011；170306)和海門(mén)慧聚藥業(yè)有限公司(批號(hào)：171101；171201；171202)。馬波沙星對(duì)照品，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號(hào)：H0801511；馬波沙星雜質(zhì)峰鑒別對(duì)照品，EP，批號(hào)：Y0002317-1。

2 方法與結(jié)果

2.1 有關(guān)物質(zhì)檢查方法

2.1.1 方法的建立過(guò)程

2.1.1.1 色譜柱的選擇 現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法流動(dòng)相基本一致，僅比例略有不同，因此，選用EP方法中的流動(dòng)相條件，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行色譜柱的選擇?，F(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法中色譜柱填料類(lèi)型均為十八烷基硅烷鍵合硅膠。研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)使用不同品牌C18色譜柱，馬波沙星主峰及各雜質(zhì)峰保留時(shí)間差別較大，且各雜質(zhì)相對(duì)于主峰的保留時(shí)間會(huì)發(fā)生變化，試驗(yàn)三種不同品牌色譜柱，主峰保留時(shí)間及各雜質(zhì)相對(duì)主峰保留時(shí)間結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，不同品牌粒徑的C18色譜柱對(duì)馬波沙星主峰及各雜質(zhì)峰的保留時(shí)間有影響。為保證主峰時(shí)間不至于過(guò)長(zhǎng)，且有穩(wěn)定的相對(duì)保留時(shí)間，因此在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中提供色譜柱品牌型號(hào)信息作為參考，擬定色譜柱條件為“用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(XTERRA C18，4.6×150 mm，5 μm或其他效能相當(dāng)?shù)纳V柱)”。

表1 不同品牌色譜柱馬波沙星主峰保留時(shí)間及各雜質(zhì)相對(duì)主峰保留時(shí)間結(jié)果表

2.1.1.2 各雜質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間的確定 雜質(zhì)鑒別對(duì)照品是一支混合對(duì)照品，溶解進(jìn)樣后發(fā)現(xiàn)在主峰之前有四個(gè)色譜峰，相對(duì)主峰的保留時(shí)間分別為0.5，0.7，0.8和0.9，給雜質(zhì)A和C的定位造成干擾。只能單獨(dú)進(jìn)樣雜質(zhì)A和C的定位溶液，確定了雜質(zhì)A和C相對(duì)于馬波沙星主峰的保留時(shí)間分別為0.7和0.9(圖1)。取雜質(zhì)鑒別對(duì)照品適量，加甲醇-水(23∶77)稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液作為系統(tǒng)適用性溶液，精密量取10 μL，按擬定液相色譜條件(2.1.2項(xiàng))連續(xù)進(jìn)樣6針，主峰及各雜質(zhì)峰的保留時(shí)間略有漂移，但各雜質(zhì)峰相對(duì)馬波沙星峰的保留時(shí)間不變，其結(jié)果見(jiàn)表2。綜上，擬定雜質(zhì)B、A、C、D、E的相對(duì)保留時(shí)間分別為0.5，0.7，0.9，1.3，1.5。

圖1 馬波沙星系統(tǒng)適用性溶液圖

表2 相對(duì)保留時(shí)間結(jié)果表

2.1.1.3 雜質(zhì)限度規(guī)定 馬波沙星的6個(gè)雜質(zhì)中，雜質(zhì)C和D為合成中間體，雜質(zhì)F主要在長(zhǎng)期貯存過(guò)程產(chǎn)生。國(guó)內(nèi)外各質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中各雜質(zhì)限度及總雜質(zhì)限度均相同，僅忽略限有不同。結(jié)合6批馬波沙星原料的有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果，各雜質(zhì)限度直接參考EP的設(shè)定。目前未對(duì)雜質(zhì)F作特別的規(guī)定，計(jì)入總雜質(zhì)達(dá)到控制的目的，在積累穩(wěn)定性數(shù)據(jù)之后，再考慮對(duì)其限度進(jìn)行規(guī)定。EP標(biāo)準(zhǔn)中將雜質(zhì)忽略限設(shè)定為0.1%，與雜質(zhì)A、B的限度一致，雜質(zhì)A、B只能是未檢出和不符合規(guī)定兩種結(jié)果，欠合理。結(jié)合方法檢測(cè)限和靈敏度考察結(jié)果，將忽略限定為0.05%。

2.1.2 有關(guān)物質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 取本品適量，加甲醇-水(23∶77)適量，超聲處理使溶解并稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加甲醇-水(23∶77)稀釋制成每1 mL中約含1 μg的溶液作為對(duì)照溶液。照高效液相色譜法(附錄0512)測(cè)定，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(XTERRA C18，4.6×150 mm，5 μm或效能相當(dāng)?shù)纳V柱)。以甲醇-冰醋酸-磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉2.7 g、辛烷磺酸鈉3.5 g，加水1000 mL使溶解，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5)(230∶5∶770)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)315 nm；流速為1.2 mL/min；柱溫為40 ℃。取馬波沙星雜質(zhì)峰鑒別對(duì)照品(含雜質(zhì)A、B、C、D、E)10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇-水(23∶77)稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液，精密量取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2.5倍，馬波沙星峰保留時(shí)間約為33 min，雜質(zhì)B、A、C、D、E峰相對(duì)于馬波沙星峰的保留時(shí)間分別約為0.5、0.7、0.9、1.3和1.5，雜質(zhì)C峰和馬波沙星峰的分離度應(yīng)大于1.5，雜質(zhì)D峰和馬波沙星峰的分離度應(yīng)大于4.0。精密量取供試品溶液和對(duì)照溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2.5倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，雜質(zhì)A、B峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積(0.1%)；雜質(zhì)C、D峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的2倍(0.2%)；雜質(zhì)E按校正后峰面積計(jì)算(乘以校正因子1.5)不得大于對(duì)照溶液主峰面積的2倍(0.2%)；按校正后峰面積計(jì)算各雜質(zhì)峰面積之和不得大于對(duì)照溶液主峰面積的5倍(0.5%)。供試品溶液色譜圖中小于對(duì)照溶液主峰面積0.5倍(0.05%)的色譜峰忽略不計(jì)。

2.1.3方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.3.1 專(zhuān)屬性 溶劑空白：以甲醇-水(23∶77)作為溶劑空白。系統(tǒng)適用性溶液：取馬波沙星雜質(zhì)峰鑒別對(duì)照品(含雜質(zhì)A、B、C、D、E)10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇-水(23∶77)稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。供試品溶液：取供試品10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇-水(23∶77)稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

精密量取上述溶液各10 μL，按照擬定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示在溶劑空白圖譜中(圖2)，馬波沙星主峰及各雜質(zhì)峰出峰處無(wú)干擾；雜質(zhì)鑒別對(duì)照品色譜圖中，馬波沙星主峰及各雜質(zhì)色譜峰峰純度均小于閾值，均為單一物質(zhì)峰。

圖2 馬波沙星有關(guān)物質(zhì)溶劑空白色譜圖

2.1.3.2 檢測(cè)限 稱(chēng)取馬波沙星對(duì)照品10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇-水(23∶77)適量，超聲使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，精密量取適量0.1 mL至100 mL量瓶中，得0.1%(1 μg/mL)的溶液，再精密量取適量，加甲醇-水(23∶77)系列稀釋?zhuān)?.05%(0.5 μg/mL)、0.02%(0.2 μg/mL)、0.01%(0.1 μg/mL)的溶液，精密量取各溶液10 μL，按照擬定的有關(guān)物質(zhì)檢查的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，0.01%溶液主峰信噪比為4.3，故有關(guān)物質(zhì)測(cè)定法的檢測(cè)限為0.01%。

2.1.3.3 精密度(重復(fù)性) 配制濃度為0.1%(1 μg/mL)的馬波沙星對(duì)照品溶液和系統(tǒng)適用性溶液，精密量取上述兩種溶液各10 μL，按照擬定標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定6次。結(jié)果：在0.1%的濃度水平下，6次測(cè)定馬波沙星峰面積RSD為1.1%；系統(tǒng)適用性溶液6次測(cè)定下各雜質(zhì)相對(duì)于馬波沙星主峰的保留時(shí)間不變，該方法的精密度良好。

2.1.3.4 耐用性 既定流速為1.2 mL/min，柱溫為40 ℃。調(diào)節(jié)流速為1.0、1.3 mL/min，調(diào)節(jié)柱溫為38、42 ℃，以系統(tǒng)適用性溶液按照擬定標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，考察方法的耐用性，結(jié)果當(dāng)流速在1.0～1.3 mL/min的范圍內(nèi)變化，柱溫在40±2 ℃的范圍內(nèi)變化，檢出的雜質(zhì)峰個(gè)數(shù)未發(fā)生改變，各雜質(zhì)峰之間的分離情況符合規(guī)定，該方法的適用性良好。

2.1.3.5 溶液穩(wěn)定性 取一批供試品溶液，按照擬定色譜條件，分別在第0、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，考察檢出雜質(zhì)峰個(gè)數(shù)和雜質(zhì)含量，結(jié)果在24 h內(nèi)，檢出的雜質(zhì)峰個(gè)數(shù)不變，雜質(zhì)量及總雜質(zhì)量未發(fā)生改變，供試品溶液穩(wěn)定。

2.1.4 有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果 取6批馬波沙星原料，按擬定色譜條件檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。所得結(jié)果與生產(chǎn)企業(yè)自檢報(bào)告中結(jié)果一致，方法可行。

表3 馬波沙星原料有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果表

2.2 殘留溶劑檢查方法

2.2.1 殘留溶劑的檢查方法建立與方法學(xué)考察 見(jiàn)作者發(fā)表的文章：頂空毛細(xì)管GC法測(cè)定馬波沙星原料藥中6種溶劑的殘留量[9]。

2.2.2 殘留溶劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 取供試品約0.1 g，精密稱(chēng)定，置頂空瓶中，精密加入N,N-二甲基甲酰胺1 mL，密封，作為供試品溶液；分別精密稱(chēng)取甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯與甲苯適量，加N,N-二甲基甲酰胺定量稀釋制成每1 mL中分別含甲醇0.3 mg、乙醇0.5 mg、乙腈0.041 mg、二氯甲烷0.06 mg、苯0.002 mg和甲苯0.089 mg 的混合溶液，精密量取1 mL，置頂空瓶中，密封，作為對(duì)照品溶液。照殘留溶劑測(cè)定法(附錄0861第二法)測(cè)定。以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷(或極性相近)為固定液的毛細(xì)管柱為色譜柱；初始溫度為40 ℃，維持10 min后，以每分鐘20 ℃的速率升溫至80 ℃，維持2 min，再以每分鐘30 ℃的速率升溫至200 ℃，維持5 min。以氮?dú)鉃檩d氣，線速為每秒24.1 cm，分流比為5∶1；進(jìn)樣口溫度為180 ℃；檢測(cè)器為火焰離子化檢測(cè)器(FID)，檢測(cè)器溫度為250 ℃；頂空瓶平衡溫度為105 ℃，平衡時(shí)間為20 min。取對(duì)照品溶液頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖，出峰順序依次為：乙醇、乙腈、二氯甲烷、苯與甲苯，各色譜峰間的分離度應(yīng)符合要求。取供試品溶液和對(duì)照品溶液分別頂空進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，均應(yīng)符合規(guī)定。

2.2.3 殘留溶劑檢查結(jié)果 取6批馬波沙星原料，按擬定殘留溶劑檢查方法檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。所得結(jié)果與生產(chǎn)企業(yè)自檢報(bào)告中結(jié)果一致，方法可行。

表4 馬波沙星殘留溶劑結(jié)果表

2.3 含量測(cè)定方法

2.3.1 含量測(cè)定方法的確立 國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定方法相同，均為電位滴定法。考慮到原料純度高且不存在輔料的干擾，容量法測(cè)定含量專(zhuān)屬性良好。為進(jìn)一步驗(yàn)證容量法測(cè)定含量的可靠性，參考馬波沙星制劑的含量測(cè)定方法(HPLC法，外標(biāo)法)[2]測(cè)定6批馬波沙星原料的含量，與電位滴定法測(cè)定結(jié)果相比較(表5)，相對(duì)偏差不大于0.02%，最終仍以電位滴定法作為馬波沙星含量測(cè)定方法。

2.3.2 含量測(cè)定方法 取本品約0.3 g，精密稱(chēng)定，加冰醋酸80 mL使溶解，照電位滴定法(附錄0701)，用高氯酸滴定液(0.1 mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正，每1 mL鹽酸滴定液(0.1 mol/L)相當(dāng)于36.24 mg的C17H19FN4O4。

2.3.3 含量測(cè)定結(jié)果 取6批馬波沙星原料，按擬定含量測(cè)定方法檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 馬波沙星原料含量測(cè)定結(jié)果表

3 討 論

3.1 破壞試驗(yàn) 為進(jìn)一步驗(yàn)證有關(guān)物質(zhì)檢查方法對(duì)雜質(zhì)的檢出能力，研究過(guò)程中進(jìn)行破壞試驗(yàn)，采用強(qiáng)光照射，酸或堿破壞，氧化破壞及加熱等方式。按照擬定的有關(guān)物質(zhì)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，馬波沙星原料在光照、加熱和常規(guī)酸堿破壞條件下比較穩(wěn)定。又采用酸堿破壞同時(shí)水浴的辦法，破壞產(chǎn)生雜質(zhì)，主要為雜質(zhì)D、E、F，均為方法本身控制的雜質(zhì)。方法本身控制的雜質(zhì)種類(lèi)齊全，已包括合成中間體雜質(zhì)，說(shuō)明方法檢出能力強(qiáng)。

3.2 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未收錄殘留溶劑檢查的原因 因各企業(yè)生產(chǎn)工藝不同，殘留溶劑種類(lèi)也不盡相同，雖然已建立的殘留溶劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)涵蓋了所有可能出現(xiàn)的殘留溶劑種類(lèi)，但參考各生產(chǎn)企業(yè)殘留溶劑檢查結(jié)果，僅檢出乙醇和甲苯兩種溶劑殘留，且殘留量均遠(yuǎn)低于限量，因此最終建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未收錄殘留溶劑檢查項(xiàng)。

3.3 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的其他項(xiàng)目 除了對(duì)有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑和含量測(cè)定項(xiàng)目進(jìn)行了重點(diǎn)研究之外，其余項(xiàng)目均參照EP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，采用6批馬波沙星原料進(jìn)行驗(yàn)證。最終建立的馬波沙星原料質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)包括性狀、鑒別(紫外光譜法和紅外光譜法)、吸光度、有關(guān)物質(zhì)、干燥失重、熾灼殘?jiān)?、重金屬、含量測(cè)定等項(xiàng)目，內(nèi)容完善，可用于馬波沙星原料的質(zhì)量控制，收載入《中國(guó)獸藥典》2020年版一部。