苗 艷，朱慶賀，陳 亮，蘭世捷，馮萬宇，李 丹，張 蕾，沈思思，田秋豐，金振華，史同瑞*，李 白

(1.黑龍江省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.呼瑪縣畜牧總站，黑龍江大興安嶺 165000)

牛冠狀病毒(Bovine coronaviruses, BCoVs)是一種嚴重危害牛健康的病原，廣泛存在于世界各地的牛群中，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大經濟損失[1]。BCoVs可引起犢牛腹瀉(Calf diarrhea, CD)和成牛冬季痢疾(Winter dysentery, WD)，以及幼牛上下呼吸道感染[2-3]，從腹瀉犢牛的糞便樣本和呼吸道樣本中常分離到BCoVs[4-6]。BCoVs廣泛分布于世界多個國家，在我國青海、新疆、遼寧、內蒙古、山東、廣西、黑龍江等省份均檢測出該病毒[7-9]。目前尚無治療BCoVs感染的特效藥物，疫苗接種和程序化防控是預防BCoVs感染的主要措施。掌握BCoVs的流行病學動態(tài)和疫苗研究狀態(tài)可對診斷BCoVs和新型疫苗的研究提供科學依據。

1 病原學

1.1 BCoVs結構和分類 BCoVs屬巢病毒目、冠狀病毒科、正冠狀病毒亞科、β冠狀病毒屬，與豬戊型肝炎病毒(HEV)、犬呼吸道冠狀病毒(CoV)及人冠狀病毒CoV-OC43 及HKU1同屬于β冠狀病毒屬2a亞群成員[10]，是一種有囊膜的單股正鏈RNA(ssRNA)病毒，直徑在65～210 nm之間，由一層短的血凝素和一層長的延伸至表面的刺突蛋白包裹?；蚪M大小在27～32 kb之間，編碼5種主要結構蛋白，包括核衣殼蛋白(N蛋白)、刺突蛋白(S蛋白)、包膜蛋白(E蛋白)、膜蛋白(M蛋白)和血凝素酯酶(HE)糖蛋白[11]。其中，核衣殼蛋白(N蛋白)在毒株中最為保守，常被用于進行病毒RNA檢測[12]。S蛋白所包含的S1亞基上有主要的中和表位，S2亞基能夠介導病毒融合蛋白，負責吸附靶細胞受體和進行膜融合。E蛋白參與病毒的裝配。M蛋白包含能夠被B細胞識別的表位。HE是一種能夠破壞受體的酶(酯酶)，能進行反向血凝。HE蛋白和S蛋白都是重要的病毒蛋白，與病毒對宿主細胞的吸附和對雞、小鼠、大鼠、倉鼠紅細胞的凝集都相關，均能誘導產生中和抗體，從而阻止病毒的吸附和感染，對抗病毒免疫和疫苗的研制至關重要[1]。

1.2 BCoVs致病機制 動物通過糞口途徑或氣溶膠的吸入感染冠狀病毒[1,13]。BCoVs通過S蛋白的S1蛋白部分結合到細胞膜受體(N-乙?；?9-O-乙酰神經氨酸)從而侵入細胞。S蛋白的S2蛋白部分調節(jié)病毒與宿主細胞膜的融合[14]。病毒的最初復制發(fā)生在呼吸道(鼻腔、氣管和肺)還是胃腸道(腸上皮細胞)目前尚且是一個有爭論的問題。一種觀點認為，最初的復制發(fā)生在呼吸道，大量的病毒被粘液保護然后被吞入從而去感染腸道[1,13];另一種觀點認為，BCoVs最開始感染的是胃腸道，然后通過病毒血癥到達呼吸道[15]。BCoVs在糞便和鼻分泌液中都有排放，病毒排放持續(xù)期較長，Kanno等2018年報道，他們通過巢式PCR對鼻腔和糞便中的病毒進行檢測，分別最長在感染后的932 d和1058 d都檢測到了病毒[16]。BCoVs傳播的最常規(guī)路線是從母畜到犢牛或在犢牛間進行傳播。畜群之間的傳播，主要通過新動物的購進或通過被病毒污染的物品。犬已被當做一種牛冠狀病毒的攜帶者[15]。BCoVs對整個胃腸道都有影響，從十二指腸開始直至大腸，導致腸絨毛萎縮和其他黏膜損傷。在呼吸道，其引起間質性肺炎、鼻甲、氣管和肺上皮損傷[13,17-18]。

2 流行病學

BCoVs是引起3周齡以內奶牛和肉牛腹瀉的主要病原之一，通過破壞腸絨毛，導致嚴重的、經常性腸道出血和腹瀉。BCoVs感染引起的WD會造成奶牛產奶量的大幅度減少，從而造成巨大的經濟損失[2]。WD主要發(fā)生在寒冷地區(qū)，但在一些熱帶國家也有報道，如泰國、巴西等[3,19]。BCoVs不僅存在于腸道中，還存在于肺臟中。根據臨床癥狀將BCoVs分為兩個群：從腹瀉的小牛和成牛中分離到的BCoVs被稱為牛腸道冠狀病毒(Bovine enteric coronaviruses，BECoVs)，從有呼吸道臨床癥狀的動物中分離到的冠狀病毒被稱為牛呼吸道冠狀病毒(Bovine respiratory coronaviruses，BRCoVs)。BECoVs再細分為引起犢牛腹瀉(CD)的BECoVs(BECoVs-CD)和引起成牛冬季痢疾(WD)的BECoVs(BECoVs-WD)[15]。牛冠狀病毒病的臨床表現(xiàn)不只與病毒本身的致病性相關，而且與宿主和環(huán)境因素相關，例如：動物自身的免疫狀態(tài)、環(huán)境溫度以及與其他病原的二次混合感染。

2.1 BECoVs流行病學 Mebus于1972年在內布拉斯加州大學偶然發(fā)現(xiàn)BCoVs后[20]，病毒很快被分離和鑒定[21]，隨后被認為是一種可引起奶牛和肉牛腹瀉的常見病原，主要通過患病牛的糞便進行傳播。最易感年齡為出生后30 d內[15]，潛伏期為1～7 d，臨床癥狀持續(xù)3～6 d[21-23]。在自然發(fā)生的牛腹瀉疾病疫情中，BECoVs感染引起的腹瀉在15%～70%之間，最早可以在剖宮產犢牛出生后24 h時，最晚至犢牛5月齡時檢測到該病毒。被感染后的犢牛開始排放大量BCoVs，可持續(xù)排放兩周，而恢復期的犢牛排毒量通常都較低[22]。在腹瀉犢牛和健康犢牛糞便中均可檢出BCoVs，但腹瀉犢牛檢測陽性率(8%～69%)要高于健康犢牛(0%～24%)[22]。盡管有血清BCoVs特異性抗體和腸道BCoVs特異性抗體存在，但仍在超過70%以上的健康牛樣品中檢測到低水平的BCoVs呈間歇性排放[22]。由于BCoVs在外界溫度較低和紫外光強度較弱時更易存活，所以在冬季的幾個月時間里，BCoVs排放率增加了50%～60%，這就可能導致成牛發(fā)生冬季痢疾[24-25]。在分娩時，BCoVs的排毒量也會增加65%，產后兩周由于母牛免疫和激素紊亂會增加71%，因此，由于產后接觸污染的會陰、乳頭和產房，BCoVs陽性母牛所產犢牛的腹瀉概率更高[24]。

2.2 BRCoVs流行病學 Thomas等于1982年首次鑒定了BCoVs為一種與犢牛肺炎相關的病毒[26]。隨后，很多研究人員也證明，盡管在個體分離株之間血清型和抗原上有差異，但BECoVs和BRCoVs都是相同準種的成員[22]。BCoVs在所有年齡段的有呼吸疾病的牛上均被分離和檢測到[1,27-28]。臨床癥狀包括流鼻涕、呼吸困難、咳嗽、發(fā)燒和呼吸窘迫等[28]。Hasoksuz等的研究證明，BRCoVs的鼻腔和糞便排毒率分別為84%和96%[29]。Thomas等的研究證明，運達飼養(yǎng)場前三天的受試牛鼻腔排毒量始終高于糞便排毒量[30]。Gulliksen等對挪威的135個奶牛場進行了BCoVs的血清學調查，結果顯示，BCoVs血清抗體陽性犢牛比陰性犢牛患呼吸疾病的危險性更高[31]。Lathrop等的研究證明，通過鼻腔排放BRCoVs的飼養(yǎng)場犢?？赡芨谆己粑到y(tǒng)疾病，且比不排放BRCoVs的動物肺部病變更嚴重[32]。鼻腔排放BRCoVs的犢牛比不排放的犢牛更易有呼吸道疾病[29-30]。

盡管已經通過流行病學調查和常規(guī)診斷得到了大量的佐證，但有關BCoVs誘導的呼吸道疾病和相關病理變化的證據仍不足。Ellis提出，僅通過在患病動物呼吸道樣品中檢測出BCoVs來判定BCoVs為誘導呼吸道疾病的病原是不足的，需進一步調查研究來證明病毒載體和臨床癥狀之間的這種因果關系[33]。BCoVs是否可以直接作為一種呼吸道病原仍存爭議。

2.3 我國BCoVs流行情況 BCoVs在我國多個省份和地區(qū)廣泛流行。彭昊等對廣西地區(qū)冠狀病毒感染引起的牛腹瀉病流行情況進行調查，結果顯示BCoVs陽性率為17%[34]。崔鑫等對新疆12個規(guī)?；膛龅?25份犢牛糞便樣品進行BCoVs檢測，結果顯示，BCoVs陽性率為9.54%[35]。Abi Keha等在我國6個省14個養(yǎng)殖場共采集腹瀉犢牛糞便190份，結果檢測到36份BCoVs陽性樣品，陽性率為18.95%[36]。何琪富等對青藏高原29個牦牛養(yǎng)殖場的336份腹瀉樣本進行BCoVs檢測，結果有232份樣品陽性，陽性率達69.05%[37]。楊海峰等對我國奶牛養(yǎng)殖量較大的14個省市的29個規(guī)?；翀鑫磾嗄痰臓倥＿M行呼吸道疾病綜合征評估，結果顯示，在176份樣品中38份BCoVs陽性樣品，陽性率為21.59%，其中采自黑龍江的病料中冠狀病毒檢出率達70%，新疆次之，同時對陽性病例與呼吸道疾病綜合征臨床癥狀的相關性分析結果表明，病畜的發(fā)熱、鼻腔分泌物性狀改變與BCoVs密切相關[7]。張坤等對新疆北疆地區(qū)規(guī)模化牛場犢牛腹瀉冠狀病毒病原進行調查，結果顯示在檢測的125份病料中BCoVs RT-PCR擴增陽性樣品檢測出65份，對N基因和S1的基因序列分析結果表明，新疆北疆地區(qū)的BCoVs與參考毒株的同源性較高，且親緣關系具有地域性[38]。我國關于BCoVs的研究起步較晚，有關其流行病學調查的研究較少，但近年來BCoVs的流行又較為嚴重，因此需要對該病毒高度重視。

3 疫 苗

3.1 BECoVs疫苗 新生犢牛較易感染BCoVs，通常在產犢前給母牛進行疫苗接種，從而使母牛產生抗體，犢牛通過母牛初乳中的抗體獲得被動免疫[39]。此外，犢牛可以在1日齡或稍微大一些日齡接種一種減毒活鼻內疫苗，可誘導一種能夠迅速產生干擾素的先天免疫應答，這會使其快速產生免疫保護作用。流行病學研究表明，中和抗體和紅細胞凝集抗體水平與所產生的保護作用相關[1]。鼻內疫苗通常在3～4日齡通過注射器一次性接種，也可當犢牛大些進入飼育場時接種鼻內疫苗。滅活疫苗也在懷孕牛上被使用。目前市面上有兩類可用于預防BCoVs引起的新生犢牛腸道疾病的疫苗。一類是滅活疫苗，包括美國輝瑞動物保健公司的Scour Guard 3(K)、美國先靈葆雅動物保健的Guardian、瑞氏諾華動物保健的Scour-Bos，這三種疫苗通過對懷孕晚期的母牛進行接種以使所產犢牛獲得被動免疫。目前認為，通過初乳被動免疫是犢牛接種BCoVs的可靠模式。只有在出生后24 h內獲得免疫孕牛產生的高水平的初乳IgG1才能保護新生犢牛免受BCoVs感染，而24 h后免疫的犢?？赡艿貌坏奖Ｗo。另一類是改良的活疫苗，包括美國默克公司的Bovilis和Guardian、美國輝瑞動物保健公司的Calf-Guard、ScourGuard 4KC和 BoviShield Gold 5、日本京都KyotoBiken實驗室的 CattleWin BC，這三種疫苗通過口服給新生犢牛以提供主動免疫。然而，在奧地利進行的一項實地研究中，這種免疫接種的效力受到質疑[15]。除了注射時間和疫苗免疫效果，還需考慮的是接種疫苗后對所選擇接種部位的影響。在早期的一項研究中發(fā)現(xiàn)，用減毒的呼吸道毒株疫苗給牛進行肌肉注射是安全的[40]。但在另一項研究中，用滅活的BCoVs和細菌成分的疫苗給牛進行肌肉注射接種，結果顯示大約有50%的牛跛行并發(fā)展為肌炎[41]。

3.2 BRCoVs疫苗 現(xiàn)代疫苗接種計劃中使用多價滅活疫苗、改良的活病毒疫苗和減毒細菌抗原來降低牛呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratory disease complex,BRDC)的發(fā)病率和流行率，但沒有一種用于預防BRCoVs的商品化的疫苗，且對BRCoVs的免疫保護研究也較少。Plummer等使用改良的冠狀病毒和輪狀病毒活疫苗鼻內接種犢牛，顯著降低了到達飼養(yǎng)場時有較低滴度BCoVs血清抗體的犢牛隨后的呼吸道疾病風險，無論是單獨使用還是與牛皰疹病毒1型(Bovine herpesvirus type 1，BHV-1)聯(lián)合使用，在降低飼養(yǎng)場牛BRDC發(fā)病率和后續(xù)治療方面可能具有協(xié)同效應或產生其他效應[42]。BCoVs抗體滴度可能與對呼吸道感染的保護作用相關，并可能減少病毒在鼻腔分泌物中的排放[43]。Hasoksuz等的研究結果顯示，BCoVs抗體滴度大于1600的牛的糞便或鼻腔不會排放BCoVs[29]。Thomas等建議，飼養(yǎng)場犢牛至少應在運輸前3周接種BCoVs疫苗，以誘導產生血清IgG滴度達1860以上，從而對BCoVs感染及其與BRDC有關的其他病原體混合感染產生保護作用[30]。

未來的疫苗研究方向是開發(fā)出一種能夠預防不同BCoVs野毒株的疫苗，以預防不同臨床癥狀的BCoVs感染。研究一種包含CD、WD和呼吸道分離株的多毒株混合疫苗可能是開發(fā)廣譜BCoVs疫苗的理想策略，這種疫苗可能有效預防各種BCoVs感染。

4 小結與展望

不同的冠狀病毒可以感染多種家畜，包括狗、貓、牛、豬和家禽等，而其中多數都能通過常規(guī)疫苗接種進行控制。BCoVs疫苗已被廣泛用于預防BCoVs感染，它能夠保護犢牛免于由BCoVs感染引起的腸道和呼吸道疾病。但目前的疫苗也存在一些缺點，如保護性免疫的持續(xù)期相對較短，缺少有效的滅活苗等，還需要進一步研究以預防該病和限制其傳播。目前有關該病毒的遺傳信息仍然有限。BECoVs和BRCoVs尚未明確區(qū)分，它們確實在很大程度上發(fā)生交叉反應。BCoVs和BRDC之間的因果關系尚未明確，這是在疾病預防或預處理計劃中必須考慮的問題。

未來的研究領域包括了解BECoVs和BRCoVs的發(fā)病機制，BCoVs和BRDC的因果關系，BCoVs與宿主和環(huán)境因素之間的相互作用關系，BCoVs的種間傳播宿主范圍和調控機制等。