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        質(zhì)粒介導(dǎo)的印第安納沙門氏菌耐藥機(jī)制及分子溯源研究

        2022-08-11 08:56:10徐紅紅張林吉王學(xué)鋒張小榮吳艷濤巢國祥
        中國人獸共患病學(xué)報 2022年7期
        關(guān)鍵詞:印第安納沙門氏菌耐藥性

        王 天,徐紅紅,張林吉,王學(xué)鋒,張小榮,吳艷濤,巢國祥,4

        沙門氏菌是重要的人獸共患病原菌,沙門氏菌的防控是個令人關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[1]。近年來動物源印第安納沙門氏菌泛耐藥克隆(ST17克隆)的出現(xiàn)和傳播,導(dǎo)致人類沙門氏菌病例增加,成為公共衛(wèi)生存在的新威脅[2-3]。

        沙門氏菌擁有的血清型數(shù)量繁多,不同血清型的抗生素耐藥性以及致病性之間均存在差異[5]。耐藥基因既可以存在于細(xì)菌染色體上,也可以存在于細(xì)菌質(zhì)粒上。質(zhì)粒是在多數(shù)G-細(xì)菌中廣泛存在的一種染色體外的遺傳因子,質(zhì)粒特性使細(xì)菌更易獲得抗生素耐藥性、增強(qiáng)細(xì)菌的致病性、代謝能力等多種特性[4],并具增強(qiáng)細(xì)菌耐藥基因傳播能力。耐藥I類整合子、轉(zhuǎn)座子Tn3、TnsA、插入序列IS26、IS91作為細(xì)菌中存在的重要可移動元件,可對外源基因進(jìn)行捕獲和表達(dá)(尤其是存在于質(zhì)粒上的整合子及移動元件)[5-6]。盛煥精等[7]通過質(zhì)粒接合的實(shí)驗說明菌株攜帶的質(zhì)粒類型和相應(yīng)的耐藥表型存在關(guān)聯(lián),并且耐藥基因可通過接合作用在不同種屬細(xì)菌間傳播,使受體菌獲得耐藥性。質(zhì)粒消除試驗可確認(rèn)相應(yīng)耐藥基因在質(zhì)粒上的存在,并可檢測其在質(zhì)粒上的穩(wěn)定性[8]。JI XM等通過質(zhì)粒的消除試驗證實(shí)質(zhì)粒在細(xì)菌耐藥中的重要作用[9]。

        本研究通過對泛耐藥的ST17型動物源性印第安納沙門氏菌進(jìn)行全基因組測序并結(jié)合NCBI基因庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)發(fā)布的動物源性泛耐藥印第安納沙門氏菌全基因序列的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)、耐藥I類整合子及移動元件、耐藥基因。 通過質(zhì)粒消除試驗分析多株多重耐藥沙門氏菌耐藥性表型、耐藥基因攜帶前后的變化并結(jié)合本實(shí)驗室質(zhì)粒接合試驗結(jié)果,以進(jìn)一步證實(shí)質(zhì)粒在沙門氏菌尤其是印第安納沙門氏菌泛耐藥性的存在和傳播中所發(fā)揮的作用。 同時與基因庫中其它腸桿菌科質(zhì)粒通過BLAST進(jìn)行同源性分析,進(jìn)一步探索印第安納沙門氏菌泛耐藥克隆的起源。

        1 材料與方法

        1.1 菌株信息 來源于前期實(shí)驗室研究8株沙門氏菌菌株,其中動物源性印第安納沙門氏菌ST17克隆菌株3株(編號分別為15、38、222),腸炎沙門氏菌1株(編號為17)、鼠傷寒沙門氏菌1株(編號為32)、德爾卑沙門氏菌1株(編號為163)[3]。

        1.2 方 法

        1.2.1 全基因組測序、組裝 利用TAKARA DNA提取試劑盒提取菌株DNA,使用PacBio○RRS II System進(jìn)行全基因組測序(NGS)。序列拼接使用SPAdes-3.5.0軟件對預(yù)處理后的IllumIna 數(shù)據(jù)和PacBio數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接組裝。本實(shí)驗室進(jìn)行的全基因NGS測序菌株為印第安納沙門氏菌株15(GenBank:CP092259.1),222(GenBank:CP031190)。

        1.2.2 質(zhì)粒同源性和結(jié)構(gòu)分析 選擇3株來源于國內(nèi)動物源性印第安納沙門氏菌研究的菌株D90(GenBank: CP022450.1)[10]、 C629(GenBank:CP015724.1)[11]、SI67(GenBank:CP050783.1)[12]進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對分析。通過NCBI以菌株15 plasmid-1全序列進(jìn)行BLAST比對,選擇同源性最高的菌株(Query Cover>85%、Per.ident>99%)溯源分析。耐藥基因使用CARD (https://card.mcmaster.ca/anaiyze) 數(shù)據(jù)庫注釋。SNP分析使用CSI Phylogeny 1.4(https://cge.cbs.dtu.dk/services/CSIPhylogeny)[13]。基因組圈圖繪制使用Blast Ring Image Generator繪制[14]。

        1.2.3 質(zhì)粒消除 采用高溫SDS質(zhì)粒消除的方法[8]: 菌株復(fù)蘇后接種于5 mL的無抗LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、220 r/min搖床過夜培養(yǎng)。取50 μL接種于2 mL的5.00% SDS LB液體培養(yǎng)基中,搖床內(nèi)37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。取50 μL接種于2 mL的無抗LB液體培養(yǎng)基中,搖床內(nèi)43 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,此為一輪質(zhì)粒消除結(jié)束,重復(fù)上述步驟進(jìn)行多輪消除。與5 mL的無抗LB液體培養(yǎng)基中,并在搖床內(nèi)37 ℃、220 r/min過夜振蕩培養(yǎng),于甘油管-80 ℃內(nèi)保存。

        1.2.4 耐藥基因的PCR檢測 使用PCR擴(kuò)增TEM-1、CTX-M、bla-OXA、sul1、aacC4、aac6-1b、dfrA17、floR、tet(A)、tet(G)、qnrB、qnrS等12種耐藥基因。

        1.2.5 藥敏實(shí)驗 運(yùn)用自動化微量肉湯稀釋法,使用藥敏板進(jìn)行藥敏實(shí)驗:頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、亞胺硫霉素(IPM)、四環(huán)素(TE)、頭孢唑啉(CFZ)頭孢西丁(FOX)、慶大霉素(CN)、氨芐西林(AMP)、氯霉素(C)、環(huán)丙沙星(CIP)、萘啶酸(NA)、阿奇霉素(AZM)、阿米卡星(AK)、卡那霉素(K)共 14 種。根據(jù)美國臨床實(shí)驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)(CLSI 2017) 判斷結(jié)果。

        2 結(jié) 果

        2.1 全基因測序的結(jié)果分析 本研究進(jìn)行的全基因NGS測序菌株222和15的結(jié)果顯示菌株222全基因組中含有1個染色體(GenBank:CP031189)和2個質(zhì)粒。質(zhì)粒222-scf71810(GenBank:CP031190)長308622 bp攜帶有27種耐藥基因、2個耐藥I類整合子。染色體上僅有emrR、gols和aac6-Iy3個耐藥基因和一些非特異性的外排泵類抗生素抗性相關(guān)基因,另一個質(zhì)粒攜帶有一個耐藥基因CTX-M。菌株15全基因組中含有1個染色體和4個質(zhì)粒,染色體長4 740 845 bp,其中一個大質(zhì)粒15-plasmid1長214 299 bp,攜帶有22種耐藥基因、1個耐藥I類整合子。菌株15 的染色體上僅有g(shù)ols、aac6-Iy兩個耐藥基因和一些非特異性的外排泵類抗生素抗性相關(guān)基因,其他質(zhì)粒上并無耐藥基因存在。3株來源于國內(nèi)動物源性印第安納沙門氏菌研究的質(zhì)粒pD90-1(GenBank:CP022451.1)全長3 222 470 bp含有23種耐藥基因和1個耐藥I類整合子;pC629(GenBank:CP015725.1)全長210 106 bp,攜帶有24種耐藥基因和2個耐藥I類整合子;pSI67-1(GenBank:CP050784.1)全長255 307 bp,攜帶有19種耐藥基因和2個耐藥I類整合子。同時5個質(zhì)?;蚪Y(jié)構(gòu)十分相似且均大于210 000 bp(圖1、圖2)。以上質(zhì)粒都攜帶了大量的轉(zhuǎn)移酶、Tn、IS等可移動元件并分布于耐藥基因兩側(cè),數(shù)量最多的可移動元件是插入序列IS26,其次是IS6和IS91。質(zhì)粒15 plamisd1、pC629、pD90-1、pSI67-1分別攜帶2-3種轉(zhuǎn)座子,質(zhì)粒222-scf71810攜帶了近10種轉(zhuǎn)座子(圖1)。

        注:紅色方塊表示抗生素耐藥基因。藍(lán)色方塊表示插入序列、轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座酶相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白。綠色方塊表示整合酶(圖中方塊大小不代表序列長度)。圖1 質(zhì)粒pSI67-1(GenBank:CP050784.1)、222-scf71810(GenBank:CP031190)、pD90-1(GenBank:CP022451.1)、pC629(GenBank:CP015725.1)和質(zhì)粒15-plasmid1的序列結(jié)構(gòu)特征Fig.1 Sequence structural features of plasmids pSI67-1 (GenBank:CP050784.1), 222-scf71810 (GenBank:CP031190.1), pD90-1 (GenBank:CP022451.1), pC629 (GenBank:CP015725.1) and plasmid 15-plasmid1

        2.2 質(zhì)粒同源性溯源結(jié)果 基于NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行質(zhì)粒15-plasmid1的 Blastn結(jié)果顯示其他的腸桿菌中也同樣存在與本研究中相似的大質(zhì)粒,其中相似度最高的32株菌株(Query Cover>85%、Per.Ident>99%)中包含了10株大腸桿菌、10株印第安納沙門氏菌、9株鼠傷寒沙門氏菌、3株腸炎沙門氏菌、1株志賀菌。33株質(zhì)粒均擁有高度相似的結(jié)構(gòu)(圖2),其中最大質(zhì)粒是來自中國浙江的大腸桿菌攜帶的質(zhì)粒pHZ003(GenBank:MN476094.1)全長320 681 bp;最小的是來自中國浙江的印第安納沙門氏菌攜帶的質(zhì)粒pTB501(GenBank:CP034820.1)全長188 527 bp。本文3株印第安納沙門氏菌攜帶質(zhì)粒也包含在其中。15-plasmid1和pD90-1同源性最高、222-scf71810和SI67同源性最高(圖3)。33株腸桿菌攜帶的耐藥基因主要包括β-內(nèi)酰胺類耐藥基因:TEM-1和OXA-1、磺胺類耐藥基因:sul1、sul2氨基糖苷類耐藥基因:Aph(6)-Id、Aph(3″)-Ib、Aph(4)-Ia、aacC4、aac(6)-Ib、氯霉素類耐藥基因catB3、季銨類耐藥基因QacEΔ1,其中有28個質(zhì)粒都攜帶有耐藥I類整合子(圖3)。

        注:基于質(zhì)粒15 plasmid1全序列BLAST結(jié)果中同源性最高的前32株(Query Cover>85%、Per.Ident>99%)使用Blast Ring Image Generator繪制的基因組圈圖(紅色:印第安納沙門氏菌、黃色:鼠傷寒沙門氏菌、藍(lán)色:腸炎沙門氏菌、黑色:大腸桿菌、綠色:志賀菌)。圖2 33株腸桿菌質(zhì)粒BRIG(Blast Ring Image Generator)比對結(jié)果FIg.2 Blast Ring Image Generator results of 33 strains of Enterobacteriaceae plasmids

        基于質(zhì)粒15 plasmid1全序列BLAST結(jié)果中同源性最高的前32株(Query Cover>85%、Per.Ident>99%)繪制的NJ進(jìn)化樹,菌株編號標(biāo)灰的部分是前文中的5個質(zhì)粒pSI67-1、222-scf71810、pD90-1、pC629(GenBank:CP015725)和15-plasmid1。圖3 33株腸桿菌質(zhì)粒SNP的Neighbor-Joining (NJ)進(jìn)化樹與耐藥基因攜帶情況Fig.3 Neighbor-Joining (NJ) tree of 33 Enterobacteriaceae plasmid SNPs and resistance-genes carriage

        2.3 質(zhì)粒消除前后耐藥基因變化 經(jīng)質(zhì)粒消除試驗后,菌株15不再攜帶TEM-1、OXA-1、sul1、aacC4、dfrA17、floR、qnrB等7種耐藥基因,菌株38不再攜帶TEM-1、bla-CTX-M、OXA-1、sul1、aacC4、dfrA17、floR,菌株222不再攜帶TEM-1、OXA-1、sul1、aacC4、aac6-1b。而菌株17攜帶的TEM-1,菌株32攜帶的floR和tet(G),菌株163攜帶的sul1等耐藥基因被消除(表1)。

        表1 質(zhì)粒消除前后耐藥基因攜帶情況Tab.1 Carriage of resistant genes before and after plasmid elimination

        2.4 質(zhì)粒消除前后耐藥性變化 在我們檢測的14種抗生素中質(zhì)粒消除前印第安納沙門氏菌均對其中的9種以上的抗生素表現(xiàn)出耐藥性。質(zhì)粒消除試驗后,菌株15 和菌株38對TE、CN、CIP、AZM、AK等抗生素恢復(fù)敏感,菌株222對CTX、CN、CIP、NA、K等抗生素恢復(fù)敏感。而其他的3種血清型的沙門氏菌耐藥性改變較小,其中菌株17 和菌株32的耐藥性沒有改變(表2)。

        表2 6株沙門氏菌質(zhì)粒消除前后耐藥性情況Tab.2 Phenotypic resistance profiles of 6 strains of Salmonella before and after plasmid elimination

        3 討 論

        印第安納沙門氏菌是近年來發(fā)現(xiàn)的泛耐藥克隆[3]。本研究結(jié)果表明印第安納沙門氏菌攜帶有200 000 bp左右的大質(zhì)粒,這些質(zhì)粒高度相似同源。該質(zhì)粒攜帶有1個以上的耐藥I類整合子、整合酶及多個轉(zhuǎn)座子Tn及多個插入序列IS。質(zhì)粒上的耐藥基因大部分都位于耐藥I類整合子上,在所有的耐藥基因和耐藥基因簇的兩側(cè)都分布了Tn3、IS26、IS6等轉(zhuǎn)座酶和插入序列。耐藥I類整合子有強(qiáng)大的從其它細(xì)菌或環(huán)境中獲得耐藥基因能力,而整合酶、轉(zhuǎn)座子、插入序列更進(jìn)一步加強(qiáng)了質(zhì)粒對耐藥基因的捕獲能力。本實(shí)驗室前期的研究表明,印第安納沙門氏菌耐藥I類整合子遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它如腸炎、鼠傷寒等沙門氏菌[15,17],而本實(shí)驗室質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗結(jié)果進(jìn)一步表明攜帶耐藥I類整合子的質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移頻率顯著高于沒有耐藥I類整合子的質(zhì)粒,且含有耐藥I類整合子的質(zhì)粒更容易在菌株之間水平傳播進(jìn)而獲得耐藥基因[18]。質(zhì)粒本身除了在耐藥基因的獲得中發(fā)揮作用,通過接合轉(zhuǎn)移等作用增加了細(xì)菌耐藥性的傳播。正是這種大質(zhì)粒的存在并被印第安納沙門氏菌獲得而導(dǎo)致印第安納沙門氏菌泛耐藥克隆的形成。

        本研究中質(zhì)粒存在許多相似的遺傳結(jié)構(gòu):如由sul1—qacEΔ1—Arr-3—CatB3—bla-OXA-1—AAC(6′)-Ib-cr6—aacC4-Aph(4)-Ia組成的耐藥基因簇;I類整合酶附近的IS26-aadA5-dfrA17-IntI1;由IS26-oqxA-oqxB-IS26組成的操縱子oqxRAB;而這些結(jié)構(gòu)在其他的菌株如大腸桿菌質(zhì)粒pAH01-4(GenBank:CP055255.1)、奇異變形桿菌MPE0734(CP053615.1)均有多個高度相似的序列,且耐藥基因的位置分布也具有相似的特點(diǎn)。腸桿菌質(zhì)粒的NJ進(jìn)化樹(圖3)結(jié)果表明這種質(zhì)粒與腸桿菌中存在的相似質(zhì)粒高度同源。大多存在于大腸桿菌和沙門氏菌中,推測這種質(zhì)粒來源于大腸桿菌。且這種質(zhì)粒有向其他腸桿菌水平傳播的可能與趨勢。

        高溫SDS的消除機(jī)制為破壞細(xì)胞膜完整性,改變質(zhì)粒在細(xì)胞膜上的結(jié)合位點(diǎn),導(dǎo)致耐藥質(zhì)粒因不能完成正常的復(fù)制及分配到子代細(xì)胞[16]不會影響染色體上的耐藥基因。質(zhì)粒消除后菌株耐藥性的改變說明在泛耐藥印第安納沙門氏菌中對CTX、TE、CN、CIP、AZM、AK、K等多種抗生素耐藥性發(fā)揮決定作用的是存在其質(zhì)粒上耐藥基因。印第安納沙門氏菌多數(shù)耐藥基因被消除,消除效果較高,說明這類位于核苷酸上的基因不穩(wěn)定,進(jìn)一步說明這類耐藥基因最大可能是位于質(zhì)粒上。本研究中同樣的耐藥基因在不同的菌株中的消除情況并不相同。消除劑的濃度以及初始的菌液濃度等因素均會對質(zhì)粒消除的效果產(chǎn)生影響[8]。其他血清型的沙門氏菌的耐藥性并沒有隨著質(zhì)粒消除發(fā)生明顯的抗生素恢復(fù)敏感現(xiàn)象。這可能是由于這類菌株中耐藥基因大部分存在于染色體上,而導(dǎo)致其攜帶的耐藥基因以及耐藥性不容易隨著質(zhì)粒的消除而消除。

        綜上所述,攜帶有耐藥I類整合子大質(zhì)粒的印第安納沙門氏菌,更易從環(huán)境或其它細(xì)菌中獲得耐藥基因,是形成印第安納沙門氏菌耐藥克隆的主要原因。此質(zhì)粒是其在環(huán)境進(jìn)化過程中從其它腸桿菌科細(xì)菌獲得。通過質(zhì)粒消除及結(jié)合試驗進(jìn)一步證明這一點(diǎn)。

        利益沖突:無

        引用本文格式:王天,徐紅紅,張林吉,等. 質(zhì)粒介導(dǎo)的印第安納沙門氏菌耐藥機(jī)制及分子溯源研究[J].中國人獸共患病學(xué)報,2022,38(7):619-625. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.076

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