申艷琴，董 錕，張 璟，蘭 光，張 陽(yáng)，李欣穎，閆 靜，劉小菊，權(quán)玉玲

沙門(mén)菌廣泛分布于自然環(huán)境中，是一種重要的食源性致病菌，也是常見(jiàn)的人獸共患病原菌，可感染人和多種哺乳動(dòng)物。人類(lèi)主要是通過(guò)攝入被沙門(mén)菌污染的水和食品，導(dǎo)致食物中毒及腸道疾病的發(fā)生，可能引起食源性疾病的暴發(fā)。沙門(mén)菌是全球食源性腹瀉疾病的主要致病菌[1-2]，我國(guó)每年腹瀉病中70%以上是由沙門(mén)菌感染引起的[3]，尤其是嬰幼兒細(xì)菌性腹瀉中沙門(mén)菌感染居首位[4]。

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的沙門(mén)菌血清型有2 600多種[5]，其中非傷寒沙門(mén)菌是引起兒童感染性腹瀉疾病中最常見(jiàn)的病原菌[6]。近年來(lái)隨著抗生素的廣泛使用，全球范圍內(nèi)沙門(mén)菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，已成為世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題[7-8]，耐藥菌株的流行增加了對(duì)抵抗力較弱的嬰幼兒臨床治療難度。本研究對(duì)蘭州市2018-2020年哨點(diǎn)醫(yī)院收集的腹瀉患兒糞便標(biāo)本進(jìn)行血清學(xué)分型及藥敏試驗(yàn)，并結(jié)合PFGE分型技術(shù)對(duì)菌株進(jìn)行同源性分析，為沙門(mén)菌引起的腹瀉病臨床診療和溯源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源 2018-2020年蘭州市哨點(diǎn)醫(yī)院腹瀉患兒糞便標(biāo)本中分離的149株沙門(mén)菌菌株。

1.2 儀器與試劑 Vitek 2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀(法國(guó)生物梅里埃公司)或PhoenixTM全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(美國(guó)BD公司)，脈沖場(chǎng)電泳儀、Gel Dol XR 凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基(法國(guó)科瑪嘉公司)、XLD(美國(guó)BD公司)，Swarm Agar(北京路橋公司)，沙門(mén)菌診斷血清(丹麥SSI公司，泰國(guó)S&A公司)，革蘭氏陰性菌藥敏檢測(cè)板(上海星佰生物技術(shù)有限公司)，限制性內(nèi)切酶XbaI(美國(guó)New England Biolabs公司)，蛋白酶K(Amresco)，大腸埃希標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 25922)，沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC H9812)。

1.3 檢測(cè)方法 根據(jù)國(guó)家《食源性疾病監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》，將哨點(diǎn)醫(yī)院上送的可疑菌株經(jīng)選擇性平板分離后純化，并使用全自動(dòng)微生物鑒定儀進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定。采用《沙門(mén)菌屬血清型診斷》中玻片凝集方法，確定對(duì)應(yīng)血清型。按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)推薦的微量肉湯稀釋法對(duì)菌株最低抑菌濃度進(jìn)行藥敏測(cè)定。根據(jù)美國(guó)PulseNet沙門(mén)菌PFGE生物標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)沙門(mén)菌分子分型，H9812作為質(zhì)控菌株。

2 結(jié) 果

2.1 沙門(mén)菌流行特征 2018-2020年從腹瀉患兒糞便中檢出149株沙門(mén)氏菌，其中2018年檢出32株，2019年檢出65株，2020年檢出52株。感染季節(jié)分布以夏秋季(5-10月)為主，占全年的90.60%(135/149)?；純耗挲g分布以1～3歲的幼兒居多，占59.73%(89/149)；其次為1歲以下的嬰兒，占20.81%(31/149)；3～6歲幼兒及6歲以上的兒童依次占12.08%(18/149)、7.38%(11/149)。

2.2 沙門(mén)菌血清型分布 149株沙門(mén)菌共鑒定出33個(gè)血清型，以D群和B群為主，分別占46.31%和37.58%。其中腸炎沙門(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌為流行的主要血清型別，分別占30.87%和28.19%，見(jiàn)表1。

表1 沙門(mén)菌血清型分布Tab.1 Salmonella serotype distribution

2.3 沙門(mén)菌耐藥特征 藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示95.97%(143/149)沙門(mén)菌對(duì)14種抗生素存在不同程度的耐藥，其中氨芐西林耐藥率(79.87%)最高，四環(huán)素(65.10%)、萘啶酸(59.73%)、頭孢唑啉(52.35%)、氨芐西林/舒巴坦(46.31%)的耐藥率均在45%以上；對(duì)亞胺培南和頭孢西丁較敏感，敏感率分別為95.30%和93.96%，見(jiàn)表2。

表2 沙門(mén)菌對(duì)各種抗生素的耐藥情況Tab.2 Drug resistance of Salmonella to various antibiotics

兩種優(yōu)勢(shì)血清型腸炎沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌除對(duì)亞胺培南敏感外，對(duì)其他抗生素均有耐藥性，耐藥率分別為97.82%(45/46)、97.62%(41/42)。腸炎沙門(mén)菌主要耐受萘啶酸、氨芐西林、頭孢唑啉，耐藥率分別為93.40%、84.70%、52.40%；鼠傷寒沙門(mén)菌主要耐受四環(huán)素、氨芐西林，耐藥率分別為92.80%、85.70%，見(jiàn)圖1。

圖1 沙門(mén)菌對(duì)各種抗生素的耐藥率Fig.1 Resistance rate of Salmonella to various antibiotics

149株沙門(mén)菌有117株為多重耐藥，多重耐藥率為78.52%，共產(chǎn)生78個(gè)多重耐藥譜。其中鼠傷寒沙門(mén)菌有29個(gè)多重耐藥譜，多重耐藥率為80.95%(34/42)，5種及5種以上的耐藥菌株占到50.00%(21/42)，發(fā)現(xiàn)1株鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)12種抗生素耐藥(CIP-CHL-NAL-GEN-TET-CTX-AMP-AMS-CAZ-CFZ-AZM-SXT)；腸炎沙門(mén)菌有19個(gè)多重耐藥譜，多重耐藥菌率為76.09%(35/46)，優(yōu)勢(shì)耐藥譜為NAL-AMP-AMS-CFZ。

2.4 PFGE分型及聚類(lèi)分析 對(duì)腸炎沙門(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌2種優(yōu)勢(shì)血清型的分離株經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ進(jìn)行PFGE分型分析。按照?qǐng)D譜經(jīng)BN軟件聚類(lèi)分析，38株腸炎沙門(mén)菌分為20個(gè)帶型(SE1～SE20)，包含2株及以上帶型有6種，分別是SE12(6株，來(lái)自2018年、2019年、2020年)、SE10(5株，來(lái)自2018年、2020年)、SE1(4株，來(lái)自2020年)、SE7(2株)、SE6(2株)、SE9(2株)、SE11(2株)見(jiàn)圖2；31株鼠傷寒沙門(mén)菌分為30個(gè)帶型，ST1帶型包含2株菌，見(jiàn)圖3。

圖2 腸炎沙門(mén)菌脈沖場(chǎng)電泳聚類(lèi)分析圖譜Fig.2 Cluster analysis of S.enteritidis by pulsed field electrophoresis

圖3 鼠傷寒沙門(mén)菌脈沖場(chǎng)電泳聚類(lèi)分析圖譜Fig.3 Cluster analysis of S.Typhimurium by pulsed field electrophoresis

3 討 論

感染性腹瀉是兒童常見(jiàn)疾病之一，尤其是嬰幼兒消化系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，免疫功能不完善，抵抗力較弱，極易引起沙門(mén)菌感染。本研究發(fā)現(xiàn)在149例由沙門(mén)菌引起的腹瀉患兒中1～3歲幼兒檢出率最高(59.73%)，與深圳監(jiān)測(cè)情況一致[9]，與河南、玉林略有不同[10-11]，感染季節(jié)多發(fā)生于夏秋季。本次分離的沙門(mén)菌血清型以腸炎沙門(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌為主，與上海、安徽地區(qū)流行優(yōu)勢(shì)血清型一致[12-13]。

隨著抗生素在臨床治療和畜牧業(yè)的廣泛應(yīng)用，沙門(mén)菌的耐藥性及耐藥種類(lèi)不斷增加。本研究顯示，蘭州地區(qū)腹瀉患兒分離出的沙門(mén)菌對(duì)各類(lèi)抗生素的耐藥率總體略高于全國(guó)水平，其中氨芐西林、四環(huán)素、萘啶酸耐藥較嚴(yán)重，第一代頭孢類(lèi)抗生素耐藥率高于第二代、第三代，這與河南、成都報(bào)道相似[10]。 環(huán)丙沙星的耐藥率為18.12%，但它的中敏率卻高達(dá)57.72%，喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的耐藥趨勢(shì)不斷上升，為小兒慎用藥物，治療沙門(mén)菌感染患兒建議不考慮此類(lèi)藥物。通過(guò)對(duì)優(yōu)勢(shì)血清型沙門(mén)菌的耐藥結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)腸炎沙門(mén)菌和鼠傷寒沙門(mén)菌除了對(duì)亞胺培南敏感外，對(duì)其他抗生素耐藥性各有不同。腸炎沙門(mén)菌對(duì)萘啶酸高度耐藥，而鼠傷寒沙門(mén)菌對(duì)四環(huán)素高度耐藥，建議結(jié)合血清型及藥敏結(jié)果對(duì)感染沙門(mén)菌患兒進(jìn)行臨床抗菌藥物治療。

在本次研究中，雖未出現(xiàn)ESBL菌株，但多重耐藥較為嚴(yán)重，多重耐藥率高達(dá)78.52%。尤其是鼠傷寒沙門(mén)菌，多重耐藥率為80.95%，5種及以上抗生素耐藥株占50.00%，其中1菌株耐受12種抗生素。腸炎沙門(mén)菌多重耐藥率為76.09%，優(yōu)勢(shì)耐藥譜為CHL-NAL-TET-AMP-AMS-CFZ-SXT。本次研究中還發(fā)現(xiàn)5株沙門(mén)菌同時(shí)耐受喹諾酮類(lèi)藥物和頭孢類(lèi)藥物，而這兩類(lèi)藥物是目前臨床治療沙門(mén)菌引起腹瀉感染首選藥物。以上菌株引起的多重耐藥不僅給患兒的臨床治療帶來(lái)困難，還極易引起食源性疾病的暴發(fā)。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)沙門(mén)菌耐藥性的監(jiān)測(cè)，了解其變遷趨勢(shì)，合理使用抗菌藥物，預(yù)防多重耐藥株的出現(xiàn)和流行。

本研究采用細(xì)菌分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”[14]PFGE分子分型，對(duì)2種優(yōu)勢(shì)血清型沙門(mén)菌分型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腸炎沙門(mén)菌同源性較高，有3個(gè)優(yōu)勢(shì)帶型。SE12帶型的6株菌來(lái)自2018年(1株)、2019年(1株)、2020年(4株)3個(gè)不同年份患兒糞便標(biāo)本，顯示此型別污染源持續(xù)存在，其中2020年4株菌分離時(shí)間非常接近，可能存在沙門(mén)菌小范圍潛在暴發(fā)。鼠傷寒沙門(mén)菌有30個(gè)帶型，型別相對(duì)分散，分布呈多樣性。因而需加強(qiáng)對(duì)嬰幼兒病例監(jiān)測(cè)，進(jìn)行溯源分析，掌握PFGE優(yōu)勢(shì)帶型，完善防控措施，防止食源性疾病暴發(fā)。

本次研究對(duì)蘭州市腹瀉患兒沙門(mén)菌進(jìn)行了血清學(xué)分型和耐藥特征分析，建立沙門(mén)菌分子分型數(shù)據(jù)庫(kù)，為感染沙門(mén)菌腹瀉患兒臨床用藥提供參考，防止多重耐藥的發(fā)生，有利于追蹤溯源。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：申艷琴，董錕，張璟，等. 蘭州地區(qū)腹瀉患兒沙門(mén)菌耐藥性與分子分型分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(7)：626-630，637. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.087