連 佳 曹 娜 崔旭鋒

山西醫(yī)科大學(xué)，山西省太原市 030000

在全球范圍內(nèi)，腎細(xì)胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)在男、女性最常見的癌癥中排名分別為第六和第十[1]，在全球最常見癌癥死亡原因中排名第十六[2]。KICH是RCC中第三種最常見的亞型，占RCC的5%～7%[3]，其在臨床病理常規(guī)診斷中由于形態(tài)學(xué)差異大，容易與良性腫瘤混淆，導(dǎo)致診斷較為困難，進(jìn)而影響治療和預(yù)后。提高診斷率、改善預(yù)后對于降低KICH的疾病負(fù)擔(dān)具有重要意義。

RCC的進(jìn)展和預(yù)后與m5C甲基化修飾有關(guān)[4]。m5C是指RNA胞嘧啶上第5位的碳原子被甲基取代，是第二常見的RNA甲基化修飾。NSUN2蛋白是主要的m5C甲基轉(zhuǎn)移酶之一。近些年來對于NSUN2的研究主要集中胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程[5-6]，而基于其分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)與KICH發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系尚未見相關(guān)報道。本研究利用生物信息學(xué)的方法對NSUN2基因及蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)分析，并通過探討NSUN2在KICH中的表達(dá)及其與KICH預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)一步分析其相互作用蛋白和與腫瘤相關(guān)免疫分子，以期為后續(xù)深入研究NSUN2的功能并揭示KICH發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后等問題提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 NSUN2的基因和蛋白序列獲取 均來自于美國國立生物技術(shù)中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網(wǎng)站中對應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。

1.2 NSUN2的基本理化性質(zhì)分析 利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)，Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)在線網(wǎng)站分析其理化性質(zhì)和親疏水性，通過SignalP-5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)在線網(wǎng)站進(jìn)行信號肽結(jié)構(gòu)分析，利用TMHMM Server 2.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)網(wǎng)站進(jìn)行跨膜區(qū)域分析。

1.3 NSUN2的亞細(xì)胞定位分析 通過PSORTⅡ(https://psort.hgc.jp/form2.html)網(wǎng)站預(yù)測完成NSUN2的亞細(xì)胞定位分析。

1.4 NSUN2的組織表達(dá)特異性 通過NCBI網(wǎng)站上的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)分析完成，TIMER2.0數(shù)據(jù)庫(http://timer.cistrome.org)包含33種TCGA的癌癥標(biāo)本，用于分析NSUN2 mRNA在不同腫瘤中的表達(dá)情況，主要考察NSUN2 mRNA在腎嫌色細(xì)胞癌中的表達(dá)。

1.5 NSUN2與腎嫌色細(xì)胞癌預(yù)后的關(guān)系 利用Sangerbox 3.0(http://vip.sangerbox.com/home.html)提取NSUN2在TCGA數(shù)據(jù)庫里多種癌癥樣本中的表達(dá)數(shù)據(jù)，分析基因表達(dá)與每種癌癥的預(yù)后關(guān)系，主要考察NSUN2 mRNA與腎嫌色細(xì)胞癌預(yù)后的關(guān)系。

1.6 NSUN2的相互作用蛋白預(yù)測 通過STRING數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org)預(yù)測與NSUN2有相互作用的蛋白，以此構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析。

1.7 NSUN2與腫瘤免疫浸潤、腫瘤微環(huán)境、免疫檢查點(diǎn)分子的關(guān)系 利用Sangerbox 3.0(http://vip.sangerbox.com/home.html)在線分析軟件中泛癌分析相關(guān)模塊完成。

2 結(jié)果

2.1 NSUN2基本理化性質(zhì)分析結(jié)果 NSUN2在NCBI基因庫中的Gene ID為54888，該基因位于人的第5號染色體5p15.31位點(diǎn)，共有19個外顯子。NSUN2蛋白的分子式為C3830H6048N1066O1145S35，總原子數(shù)達(dá)到12 124，相對分子質(zhì)量為86 471。該蛋白含有767個氨基酸殘基，其中共含有74個亮氨酸，為9.65%，占比重最大，色氨酸為1.72%，占比重最小。NSUN2蛋白中帶負(fù)電荷殘基(天冬氨酸殘基+谷氨酸殘基)的總數(shù)為106，帶正電荷殘基(精氨酸殘基+賴氨酸殘基)的總數(shù)為99，理論等電點(diǎn)為6.33，呈弱酸性。用ProtParam軟件對NSUN2的半衰期、穩(wěn)定性、脂肪系數(shù)、親疏水性等性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示由于NSUN2蛋白在N端的氨基酸為蛋氨酸，因此其在哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞中半衰期可達(dá)30h；NSUN2的不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)為52.11，判定該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白；此外該蛋白脂溶指數(shù)為77.04，親水性總平均值為-0.57，說明該蛋白質(zhì)為親水性蛋白質(zhì)。隨后利用Protscale軟件對NSUN2蛋白進(jìn)行親疏水性預(yù)測，結(jié)果顯示最低點(diǎn)位于555號的甘氨酸殘基，得分為-2.84，最高點(diǎn)位于424號的纈氨酸殘基，得分為2.56。NSUN2蛋白的氨基酸殘基多數(shù)位于零點(diǎn)以下的負(fù)性親水區(qū)域，且相對值較大，因此蛋白親水性蛋白，與上述ProtParam軟件預(yù)測結(jié)果一致。利用SignalP 5.0 Server對NSUN2蛋白信號肽切割位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該蛋白中存在信號肽的可能性為1.5×10-3，說明NSUN2不含信號肽結(jié)構(gòu)，屬于非分泌蛋白。通過TMHMM Server 2.0預(yù)測提示該蛋白不具有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。

2.2 NSUN2組織表達(dá)特異性、亞細(xì)胞定位 NCBI中的Nucleotide數(shù)據(jù)庫可以確定所有蛋白質(zhì)編碼基因的組織特異性。本研究對來自95個樣本的27種不同組織的RNA-seq結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示NSUN2在淋巴結(jié)中的表達(dá)最為廣泛，其用于估計基因表達(dá)量的RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped reads)值為14.21±4.57，在胰腺中的表達(dá)最低。利用PSORT Ⅱ?qū)SUN2的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，60.90% NSUN2蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)，21.70%位于線粒體，17.40%位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.3 NSUN2在腎嫌色細(xì)胞癌中的相對表達(dá)水平 癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)是由美國國家癌癥研究所和國家人類基因組研究所合作建立的癌癥研究項目，目前共收錄了33種癌癥類型。本研究利用TIMER2.0數(shù)據(jù)庫分析33種腫瘤類型中NSUN2 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果提示在腎嫌色細(xì)胞癌(KICH)中NSUN2 的表達(dá)顯著高于正常腎組織 (P<0.05)，見圖1。利用Sangerbox 3.0分析NSUN2表達(dá)與TCGA數(shù)據(jù)庫中每種癌癥的預(yù)后關(guān)系，結(jié)果顯示KICH中NSUN2高表達(dá)預(yù)后差[P<0.05,HR=12.23(1.64, 91.08)]。見圖2。綜上可見NSUN2可能是KICH潛在的預(yù)后因素。

圖1 TIMER2.0分析TCGA數(shù)據(jù)庫中NSUN2在腎嫌色細(xì)胞癌組織和正常腎組織中的相對表達(dá)水平

圖2 Sangerbox 3.0分析TCGA數(shù)據(jù)庫中NSUN2表達(dá)與KICH預(yù)后的關(guān)系

2.4 NSUN2的蛋白相互作用關(guān)系預(yù)測結(jié)果 蛋白質(zhì)的相互作用在機(jī)體的眾多生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，為鑒定與NSUN2相互作用的可能蛋白，本研究利用STRING軟件對NSUN2相關(guān)蛋白進(jìn)行了蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，選擇最高置信度0.90，互作蛋白數(shù)量不超過10個，做出PPI網(wǎng)絡(luò)圖。預(yù)測結(jié)果顯示，符合條件的NSUN2互作蛋白分別為：核仁核酸蛋白1(Nucleophosmin 1，NPM1，分值：0.99)，甲基轉(zhuǎn)移酶1(Methyltransferase 1，METTL1，分值：0.99)，極光酶B(Aurora kinase B，AURKB，分值：0.97)，tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(tRNA methyltransferase 1，TRMT1，分值：0.96)，核仁素(Nucleolin，NCL，分值：0.95)，F(xiàn)tsJ RNA 2’-o-甲基轉(zhuǎn)移酶3(FtsJ RNA 2’-O-methyltransferase 3，F(xiàn)TSJ3，分值：0.95)，纖維蛋白(Fibrillarin，F(xiàn)BL，分值：0.94)，核糖體生物發(fā)生因子1(Pescadillo ribosomal biogenesis factor 1，PES1，分值：0.93)，天門冬氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶1(tRNA aspartic acid methyltransferase 1，TRDMT1，分值：0.93)，假尿苷合酶7(Pseudouridine synthase 7，PUS7，分值：0.93)。交互網(wǎng)絡(luò)共包括11個節(jié)點(diǎn)，35條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為6.36，該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)的聚類P值<0.01。同時利用STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行NSUN2基因GO功能注釋和KEGG通路分析，結(jié)果顯示NSUN2主要涉及RNA的修飾和裝配等一系列相關(guān)生物過程；細(xì)胞組分主要集中在細(xì)胞核內(nèi)；參與的KEGG信號通路主要有RNA代謝，rRNA和tRNA修飾加工等(見表1)。上述結(jié)果可能有助于我們探索NSUN2在體內(nèi)的相關(guān)作用機(jī)制和通路。

表1 NSUN2和相關(guān)基因的GO功能注釋和KEGG通路分析

2.5 NSUN2與KICH中免疫浸潤、腫瘤微環(huán)境、免疫檢查點(diǎn)分子的關(guān)系 為進(jìn)一步探討NSUN2與免疫之間的潛在關(guān)系，利用Sangerbox 3.0在線分析軟件從腫瘤免疫浸潤、腫瘤微環(huán)境和免疫檢查點(diǎn)三個方面對其進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在KICH中，NSUN2表達(dá)與M1型巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫浸潤顯著相關(guān)。在腫瘤微環(huán)境方面，NSUN2與StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore無相關(guān)性(P>0.05)。免疫檢查點(diǎn)分子和NSUN2之間的共表達(dá)分析提示，在TCGA數(shù)據(jù)庫的KICH中，NSUN2與CD276、VEGFA、TNFB1及TLR4等顯著相關(guān)(均P<0.05)。

3 討論

KICH在RCC中占比為5%～7%，相比RCC的其他類型，例如透明細(xì)胞樣腎細(xì)胞癌(clear cell RCC,ccRCC)和乳頭狀腎細(xì)胞癌(papillary RCC),KICH的預(yù)后明顯較好[7]，然而KICH容易轉(zhuǎn)移至肝臟，對預(yù)后和患者生存質(zhì)量不利。因此尋找有效的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，有助于實現(xiàn)KICH的早期診斷并改善預(yù)后。本文通過運(yùn)用多種生物信息學(xué)工具對NSUN2基因及蛋白進(jìn)行了結(jié)構(gòu)、功能以及生物學(xué)功能的預(yù)測和分析，并通過對TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行挖掘揭示了NSUN2表達(dá)與KICH患者生存率之間的關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果表明，NSUN2蛋白為弱酸性蛋白，具有不穩(wěn)定性和親水性，不含信號肽結(jié)構(gòu)，屬于非分泌蛋白，主要分布在細(xì)胞核內(nèi)。NSUN2蛋白在人體組織中發(fā)布較為廣泛，主要作為RNA甲基轉(zhuǎn)移酶行使RNA修飾功能，參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

TCGA數(shù)據(jù)庫挖掘結(jié)果提示，與正常腎組織相比，NSUN2在KICH腫瘤中高表達(dá)，并且表達(dá)升高與預(yù)后相關(guān)，說明NSUN2可能作為KICH的潛在預(yù)后因素。現(xiàn)有研究表明NSUN2與膀胱尿路上皮癌、胃癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌等許多癌癥的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等有關(guān)[8-9]，也有研究分析提示在12個m5C有關(guān)的調(diào)控因子中，有11個與RCC的預(yù)后相關(guān)，其中包括NSUN2[10]。

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析有助于從系統(tǒng)角度探究疾病分子機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新藥的作用靶點(diǎn)等。為進(jìn)一步了解NSUN2在KICH中的生物學(xué)功能和潛在信號通路，本研究構(gòu)建蛋白質(zhì)互作PPI網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行KEGG分析。STRING互作蛋白分析結(jié)果表明NSUN2的互作蛋白包括NPM1、METTL1、AURKB、TRMT1、 NCL、FTSJ3、FBL、PES1、TRDMT1和PUS7等。

NPM1與核糖體生物發(fā)生和p53穩(wěn)定調(diào)控有關(guān)，有研究表明DDX31可能通過與NPM1的相互作用，調(diào)控p53-HDM2通路和rRNA基因轉(zhuǎn)錄，在腎癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用[11]。METTL1介導(dǎo)m7G甲基化影響mRNA的翻譯和胚胎干細(xì)胞的自我更新和分化，同時還與肝癌、結(jié)腸癌等癌癥有關(guān)。AURKB是細(xì)胞有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與染色體凝集、胞質(zhì)分裂等生理過程，同時AURKB也被證明在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展和化療反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。此外有研究發(fā)現(xiàn)AURKB在RCC組織中表達(dá)升高，并與RCC患者組織中的ALKBH5表達(dá)呈正相關(guān)，ALKBH5可能通過m6A依賴的方式調(diào)控AURKB從而促進(jìn)RCC中的細(xì)胞增殖[12]。TRMT1作為tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶可能與腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后有關(guān)[13]。FTSJ3可以與NIP7產(chǎn)生相互作用并且參與rRNA的裝配，并且可能對癌細(xì)胞的侵襲和遷移具有抑制作用。TRDMT1同樣作為m5C的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制腫瘤的分化和遷移。由此可見，NSUN2可能與PPI網(wǎng)絡(luò)的下游蛋白產(chǎn)生相互作用，通過參與mRNA的轉(zhuǎn)錄后修飾進(jìn)而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

本研究進(jìn)一步從腫瘤微環(huán)境、腫瘤免疫浸潤和免疫檢查點(diǎn)分子四個方面探討了NSUN2與免疫之間的潛在關(guān)系。有研究表明，腫瘤免疫浸潤與RCC臨床預(yù)后密切相關(guān)[14]，并且發(fā)現(xiàn)有些癌癥預(yù)后相關(guān)基因與免疫細(xì)胞途徑和檢查點(diǎn)分子顯著相關(guān)[15]。本研究結(jié)果提示在腫瘤免疫浸潤方面，NSUN2與M1型巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫浸潤顯著相關(guān);NSUN2和免疫檢查點(diǎn)分子的共表達(dá)分析表明，該基因與TCGA數(shù)據(jù)集中KICH中的CD276、VEGFA、TNFB1及TLR4等顯著相關(guān)。上述結(jié)果無疑都表明NSUN2與KICH的免疫密切相關(guān)。

本研究的特色在于通過生物學(xué)在線軟件預(yù)測了NSUN2基因和蛋白的理化性質(zhì)，并進(jìn)一步挖掘了TCGA數(shù)據(jù)庫中NSUN2在KICH中的表達(dá)，此外還分析了NSUN2相關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)、腫瘤微環(huán)境、腫瘤免疫浸潤、免疫檢查點(diǎn)分子等。綜上所述，NSUN2可能是KICH的一個潛在預(yù)后預(yù)測因子，并與免疫密切相關(guān)。本文不足之處：首先，從TCGA數(shù)據(jù)庫中能夠獲得的臨床信息有限，包括潛在慢性病、免疫治療的使用、腎切除術(shù)后復(fù)發(fā)等重要數(shù)據(jù)不能體現(xiàn)，并且TCGA中正常腎組織樣本的樣本量相對較小，可能會影響預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。其次，生物信息學(xué)分析結(jié)果提示NSUN2在KICH組織中上調(diào)。但是該結(jié)果仍需要臨床樣本中驗證，本研究中利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測出的可能的機(jī)制后續(xù)仍有待進(jìn)一步的細(xì)胞實驗和動物實驗進(jìn)行驗證。但本研究得出的結(jié)論仍可為進(jìn)一步探討NSUN2在腎嫌色細(xì)胞癌中的作用以及可能存在的機(jī)制提供理論依據(jù)。