王 歡，陳 雪，趙 欣，季茂勝，張藍江，董玉芳，魏彩冰，李 文

成都市血液中心血液篩查實驗室，四川成都610041

自2010年我國實行獻血者標本核酸檢測試點工作以來，輸血安全問題在很大程度上得到了改善[1]。核酸檢測能縮短檢測窗口期，降低經輸血傳播疾病的發(fā)病率[2-3]。2015年血站實行核酸檢測全覆蓋，我國所有血站的血液標本均需進行核酸檢測，更大程度保障了輸血安全[4]。

目前，血站核酸檢測原理主要基于轉錄介導的擴增(TMA)和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)兩種方法[5]。后者的檢測模式是先將標本進行混樣檢測，結果為非反應性的孔位中所含標本視為檢測合格；結果為反應性的孔位進行拆分，拆分結果為反應性的標本被判定為核酸檢測不合格。

本中心自2010年參加血站核酸檢測試點工作以來，對COBAS s 201核酸系統(tǒng)混樣檢測呈反應性的孔位，在按照既定程序進行拆分的同時，均加做一次拆分，以達到雙孔復試的目的。上述拆分模式在全國范圍內少見。2次拆分的結果可能出現2次均未拆出、2次均拆出、僅第1次拆出、僅第2次拆出，以及同一孔位拆出不止1例反應性標本等幾種情況。本研究統(tǒng)計近6年來該核酸系統(tǒng)的檢測結果，回顧性分析2次拆分結果，分析混樣和拆分CT值的相關性，并探討對反應性孔位進行2次拆分的必要性。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2015—2020年COBAS s 201核酸系統(tǒng)上混樣檢測呈反應性的725 孔位及拆分出的543例乙型肝炎病毒(HBV)-DNA反應性標本作為研究對象。獻血者中男365例，女100例；年齡18～60歲，平均(46.61±8.50)歲。所有標本均來自經體檢合格的無償獻血者。

1.2儀器與試劑 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測采用全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)(Microlab FAME，瑞士Hamilton公司)，血型檢測采用全自動加樣儀(深圳市愛康生物科技股份有限公司)，轉氨酶檢測采用全自動生化分析儀(日本奧林巴斯公司)。轉氨酶試劑(美國貝克曼庫爾特公司)，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)試劑(意大利索靈診斷和上?？迫A生物工程股份有限公司)，抗-丙型肝炎病毒(HCV)(美國奧森多醫(yī)療和上海科華生物工程股份有限公司)，抗-人類免疫缺陷病毒(HIV)1/2(美國伯樂公司和北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司)，抗-梅毒螺旋體(TP)(北京華大吉比愛生物技術有限公司和北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司)。核酸檢測為羅氏COBAS s 201核酸檢測系統(tǒng)及配套試劑盒。

1.3方法 標本采集前，對獻血者進行乙型肝炎表面抗原(膠體金法)和轉氨酶初篩檢測。體檢和初篩檢測結果合格的獻血者再進行采血并留樣。2管留樣標本，1管是乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝的真空采血管(科華)，用于ELISA、轉氨酶和血型檢測。1管是無DNA酶，RNA酶帶分離膠的EDTA-K2抗凝的BD試管，用于核酸檢測。標本處理方法符合國家要求。

在完成轉氨酶、血型和ELISA檢測后，篩選合格標本進行核酸檢測。對所有在COBAS s 201系統(tǒng)混樣(6混1)檢測呈反應性孔位，均采取2次拆分的檢測模式。第1次拆分選用系統(tǒng)上“l(fā)oad secondary”的加樣模式，儀器根據混樣結果識別樣本條碼，自動進行拆分加樣。第2次拆分選擇“pool of 1”的加樣模式。系統(tǒng)不能識別重復條碼，在第2次拆分錄入條碼時，采取“原條碼”+“=”的輸入方式。

1.4統(tǒng)計學處理 采用Excel 2017處理數據及繪制圖表。用SPSS23.0數據分析軟件進行數據處理及統(tǒng)計分析。計數資料采用頻數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman相關分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.12015—2020年混樣反應性孔位 2次拆分結果 對725孔混樣反應性孔位進行2次拆分，共有543例HBV-DNA反應性標本，拆出反應性率為74.90%。拆分結果見表1。340孔(46.90%)在2次拆分中均拆出同一HBV-DNA反應性標本；210孔(28.90%)2次拆分結果均為非反應性；108孔(14.90%)只在第1次拆分出1例HBV-DNA反應性標本；41孔(5.67%)僅第2次拆分出1例HBV-DNA反應性標本。26 孔(3.59%)拆出2例以上反應性標本，其中19 孔(CT值35.2～44.6)在2次拆分均有相同反應性標本拆出(表2中第1～4類)，7孔(CT值36.7～39.6)雖然拆出不止1例反應性標本，但2次拆分的結果不相同(表2第5～6類)，見表2。

表1 2015—2020年混樣反應性孔位 2次拆分結果[n(%)]

表2 拆出2例及以上反應性標本的孔位拆分結果(n)

2.2混樣結果與拆分CT值之間的關系 混樣CT值<35的30孔，拆出反應性率為100.00%。且除1孔僅第1次拆分呈反應性結果外，其余29 孔均是2次拆分為同一反應性。見表3。當混樣CT值<40時，兩次拆分均為同一反應性標本的比例隨著混樣CT值降低而增加；當混樣CT值<45時，兩次拆分均為非反應性的比例隨著混樣CT值降低而降低；混樣CT值與拆分結果之間關系的線性趨勢見圖1。

圖1 混樣CT值與拆分結果關系圖

表3 混樣CT值與拆分結果[n(%)]

2.3混樣CT值與拆分CT值的相關性分析 分析4種不同拆分結果對應的混樣CT值(拆出2例及以上反應性標本的26孔因數據少不納入統(tǒng)計分析)，2次拆分為同一反應性、2次拆分均呈非反應性、僅第1次拆分呈反應性、僅第2次拆分呈反應性標本的CT值分別是(37.82±3.38)、(39.55±3.60)、(38.73±3.46)、(38.44±2.14)。混樣CT值與拆分CT值呈正相關(r=0.243，P<0.05)。見表4。

表4 混樣與拆分CT值統(tǒng)計分析

3 討 論

本中心核酸檢測實驗室從建立至今，對在COBAS s 201核酸系統(tǒng)上混樣檢測呈反應性的孔位均進行2次拆分，以達到雙孔復試的目的，為保障輸血安全投入了大量的財力和人力。其中，2016年混樣反應性孔位數量明顯少于其他年份，是因當年在該系統(tǒng)上進行核酸檢測的標本總量較少所致。

2015—2020年該系統(tǒng)725孔反應性孔位進行2次拆分后，共拆分出543例HBV-DNA反應性標本，拆出反應性率為74.90%，高于深圳、無錫和東莞地區(qū)(拆出反應性率分別是66.7%、66.67%、61.25%)[6-8]。本研究共有41例HBV-DNA反應性標本來自第2次拆分，拆分CT值最大47.30，最小35.21。姚鳳蘭等[9]對63例隱匿性HBV感染標本的感染狀態(tài)分析發(fā)現，49例(77.78%)標本HBV-DNA水平低于20 IU/mL。陳少彬等[10]研究發(fā)現，在單檢模式下，HBV水平為20 IU/mL時的漏檢率為7.55%，低于混樣模式下的漏檢率81.4%(P<0.05)。低病毒拷貝標本在進行混樣檢測時，漏檢的概率較單檢更高。根據泊松分布原則，低病毒拷貝標本在取樣時，可能會由于病毒顆粒分布不均導致病毒檢測呈非反應性。因此，對于低病毒拷貝標本，2次拆分可以增加反應性標本的檢出率，減少經輸血傳播疾病的發(fā)生，更保障了輸血安全。

有研究指出，CT值大小與標本中病毒的原始拷貝數呈線性反比關系[11]。但當標本中病毒拷貝數低或者接近檢測下限時，定性檢測的混檢與拆分CT值相關性較差，定性檢測的CT值分析難以得出準確的趨勢關系[8]。本研究中，混樣CT值較高(>40)時，出現混樣與拆分結果線性關系不強的情況，可能與上述原因有關。

拆出2例及以上反應性標本的26孔中，19孔(CT值35.2～44.6)在2次拆分均有相同反應性標本拆出，說明在上述孔位中，可能同時存在2例病毒拷貝數較高的標本，才能在2次拆分中均呈反應性結果；7孔(CT值36.7～39.6)2次拆分的反應性標本不相同，可能原因是標本僅含有低拷貝數HBV-DNA，根據泊松分布原則，存在病毒分布不均勻的情況，導致2次拆分結果不一致，此外，也存在假陽性的可能[11]。

除同時拆出2例及以上的26孔(未納入分析)，其余4種拆分結果的混樣CT值與拆分CT值呈正相關(r=0.243，P<0.05)，即混樣CT值越小，拆分出的反應性標本CT值越小；混樣CT值越大，拆分出的反應性標本CT值越大，當2次拆分均呈非反應性時，混樣CT值最大。從理論上來講，每經過3.3個熱循環(huán)靶模板總量增加一個數量級[12]?；鞓覥T值<35的30孔，拆出反應性率是100.0%，且除1孔外，其余全是2次拆分均呈反應性。只有第1次拆分呈反應性的108孔(1例除外)和只有第2次拆分呈反應性的41孔，混樣CT值均≥35。因此，筆者認為混樣CT值為35是一個關鍵點。在COBAS s 201核酸系統(tǒng)檢測獻血者標本時，若混樣CT值<35且首次拆分結果呈非反應性，需重點關注，最好進行復查，避免標本漏檢或者假陰性情況的出現，從而導致輸血感染等嚴重后果。

同時，核酸檢測假陽性結果也值得注意。采用標準化的程序檢測獻血者標本，規(guī)范工作人員的操作，保持儀器設備良好的運行狀態(tài)，加強實驗室的環(huán)境監(jiān)控等措施能有效減少假陽性結果的出現。另外，本研究缺少反應性標本的確認結果，在未來應對可疑標本進行追蹤，確認其真實的感染狀態(tài)，從而保障血液安全，減少血液浪費。