劉玉娟,吳云霄,魏燕高△

楊凌示范區(qū)醫(yī)院：1.耳鼻喉科；2.神經(jīng)內(nèi)科，陜西咸陽 712100

變應(yīng)性鼻炎(AR)是一種I型過敏性免疫球蛋白E(IgE)依賴型鼻黏膜疾病，由吸入的過敏原包括塵螨、花粉和動物皮屑等引起[1]。AR對患者生活質(zhì)量產(chǎn)生了較大影響，也給社會醫(yī)療服務(wù)造成了一定負(fù)擔(dān)，現(xiàn)已成為全世界重大公共衛(wèi)生問題[2-3]。目前，AR的發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明。有研究表明，在多數(shù)情況下運(yùn)用抗組胺藥和皮質(zhì)類固醇激素可以減輕AR癥狀[4]，但是，耐藥性的產(chǎn)生使AR患者難以治愈。因此，迫切需要開發(fā)新穎且有效的藥物來治療AR。

補(bǔ)體C5a是活化的補(bǔ)體系統(tǒng)C5裂解后的小分裂片段產(chǎn)物，其能夠促進(jìn)炎癥因子的釋放，通過與特定的補(bǔ)體5a受體(C5aR)結(jié)合發(fā)揮作用，已有研究表明，C5a激活后參與多種疾病反應(yīng)，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、敗血癥、缺血再灌注損傷和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等[5-7]。目前，靶向C5a和C5aR開發(fā)抗體以及小分子化合物已成為多種疾病的治療靶點，其中，抗C5aR抗體是C5a拮抗劑，可抑制C5a的活性從而減輕炎性反應(yīng)。為了探索抗C5aR抗體對AR的作用，本研究以構(gòu)建的大鼠AR模型為研究對象，觀察抗C5aR抗體施用后的效果，為臨床AR的治療提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料來源 60只無特定病原體(SPF級)Wistar大鼠，雌雄各30只，4～6周齡，體質(zhì)量160～220 g，由本院SPF級動物實驗中心提供，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物環(huán)境條件下，實驗期間自由飲水、攝食。

1.2儀器與試劑 抗C5aR抗體購自上海吉爾生物化學(xué)有限公司，Jagged1肽、卵清蛋白(OVA)和氫氧化鋁[Al(OH)3]干粉購自美國Sigma公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，HE染色試劑盒、PAS染色試劑盒和免疫組織化學(xué)染色試劑購自武漢博士德生物公司，抗體Notch1、Jagged1、RORγt、Foxp3購自美國Cell Signaling公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/山羊抗鼠和β-actin購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，BCA蛋白檢測試劑盒和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光液購自上海碧云天生物研究所。

1.3方法

1.3.1大鼠AR模型制備 建立Wistar大鼠AR模型，具體按照參考文獻(xiàn)[8]方法操作。首先進(jìn)行基礎(chǔ)致敏，將0.3 mg OVA和30 mg Al(OH)3加入1 mL的生理鹽水混合均勻，制成混懸液，通過腹腔注射，隔日注射1次，共注射7次，用時14 d，同時對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水；接著進(jìn)行鼻腔激發(fā)，致敏后的大鼠取2%OVA進(jìn)行滴鼻，采用微量進(jìn)樣器從鼻腔滴入，每側(cè)滴入50 μL，每天1次，連續(xù)7 d，對照組以等量生理鹽水滴入鼻腔。末次鼻腔激發(fā)后，進(jìn)行表觀行為學(xué)指標(biāo)評估大鼠AR模型是否造模成功，觀察30 min內(nèi)大鼠噴嚏、鼻溢和搔鼻動作行為，采用疊加量化計分，具體為(1)噴嚏：1～4個為1分，>4～10個為2分，>10個為3分；(2)流鼻涕：流至鼻孔前為1分，流出鼻孔為2分，流至面部計為3分；(3)撓癢：單前肢偶有撓鼻為1分，雙前肢撓鼻為2分，雙前肢不停撓鼻為3分。疊加評分總分>5分，判斷為造模成功。

1.3.2分組與給藥 將60只Wistar大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，包括對照組、模型組、抗C5aR抗體組、抗C5aR抗體+Jagged1組，每組15只。除對照組外其余3組大鼠均建立AR模型，對照組予以生理鹽水處理。造模完成后，抗C5aR抗體組大鼠腹腔注射20 μL抗C5aR抗體(10 μg/mL)，抗C5aR抗體+Jagged1組大鼠腹腔注射20 μL抗C5aR抗體(10 mg/kg)，同時注射5 μL Jagged1鈦(10 μg/mL)，對照組和模型組注射等體積的生理鹽水，每周注射1次，共持續(xù)4周。

1.3.3ELISA 斷頸法處死各組大鼠，通過眼眶采血，將收集的血液靜置于室溫下2 h，接著以4 000 r/min離心15 min，分離血清，保存在-80 ℃冰箱中。使用大鼠特異性ELISA試劑盒檢測血清中IgE、干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10和IL-17的水平，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4HE染色 處死大鼠后分離鼻骨前皮膚，咬除鼻骨，取雙側(cè)鼻腔黏膜組織，迅速清洗干凈，置于4%多聚甲醛中固定；將固定好的組織常規(guī)石蠟包埋，在切片機(jī)上切成5 μm的組織薄片，通過HE染色觀察組織學(xué)改變。步驟包括：組織切片采用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，加入蘇木精染色5 min，流水沖洗干凈，再加入伊紅染色3 min，流水再次沖洗干凈，利用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，通過光學(xué)顯微鏡觀察鼻腔黏膜組織形態(tài)變化，并隨機(jī)選擇6個不同視野觀察計數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目，取平均值作為結(jié)果。

1.3.5PAS染色 取制備的鼻腔黏膜組織石蠟切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，將切片置于阿利新藍(lán)溶液中浸泡10 min，流水沖洗干凈，置于過碘酸溶液中氧化5 min，接著浸入Leagene Schiff Reagent中染色10 min，流水沖洗后，通過Mayer Lillie蘇木素染色液染核，酸性乙醇分化，加入氨水溶液返藍(lán)，洗凈后，再次進(jìn)行脫水與透明處理，中性樹膠封片，通過光學(xué)顯微鏡觀察鼻腔黏膜組織染色情況，并隨機(jī)選擇6個不同視野觀察計數(shù)杯狀細(xì)胞數(shù)目，取平均值作為結(jié)果。

1.3.6免疫組織化學(xué)染色 鼻腔黏膜組織石蠟切片經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，置于0.3%過氧化氫中30 min，并通過高溫(98 ℃)加熱5 min進(jìn)行抗原修復(fù)，接著加入山羊血清，室溫孵育1 h，將切片與兔抗Notch1(1∶200)一抗工作液，在4 ℃共同孵育過夜。PBS緩沖液清洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)二抗工作液，在室溫下孵育1 h，在切片上滴加 DAB 顯色，自來水清洗干凈，加蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織中陽性表達(dá)并捕獲圖像，胞質(zhì)染成黃色至棕色即為陽性，隨機(jī)選擇6個視野，采用Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計陽性表達(dá)面積。

1.3.7Western blot 將鼻腔黏膜組織充分剪碎，PBS緩沖液清洗干凈，加入RIPA裂解緩沖液提取組織總蛋白，通過BCA法測定蛋白質(zhì)含量。以30 μg各組蛋白樣品加樣，通過10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，TBST洗膜，加入RORγt(1∶1 000)、Foxp3(1∶1 000)、Notch1(1∶1 000)與Jagged1(1∶1 000)一抗工作液，以β-actin作為內(nèi)參蛋白(1∶1 000)，4 ℃下孵育過夜。次日，TBST洗膜，加入對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗工作液(1∶5 000)，室溫下孵育1 h，TBST洗膜后，滴加ECL發(fā)光液顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image Pro-Plus分析系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值，計算各蛋白表達(dá)水平。

1.3.8流式細(xì)胞術(shù)分析外周血CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)和CD4+IL-17A+輔助性T細(xì)胞17(Th17細(xì)胞)百分比 采集各組小鼠外周血，流式細(xì)胞儀檢測Treg、Th17細(xì)胞比例，取肝素抗凝血，在避光條件下加入抗體，Treg細(xì)胞以CD4/Foxp3標(biāo)記，Th17細(xì)胞以CD4/IL-17A標(biāo)記，室溫孵育15 min，接著加入500 μL裂解液，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，加入1.5 mL PBS緩沖液，置于離心機(jī)中以2 500 r/min離心10 min，棄上清液后加入PBS緩沖液輕輕混勻，立即通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1建模后4組大鼠表觀行為學(xué)評分比較 末次鼻腔激發(fā)后，4組大鼠30 min內(nèi)噴嚏、鼻溢和搔鼻動作行為的評分結(jié)果見表1。對照組大鼠未見明顯的噴嚏與流涕表現(xiàn)，偶有抓鼻；而模型組、抗C5aR抗體組和抗C5aR抗體+Jagged1組的大鼠均表現(xiàn)出煩躁不安，打噴嚏、流涕以及頻繁抓鼻等現(xiàn)象，表觀行為學(xué)評分均高于5分，且明顯高于對照組(P<0.05)，說明AR模型構(gòu)建成功。

表1 4組大鼠表觀行為學(xué)評分比較分)

2.24組大鼠血清IgE水平比較 模型組大鼠血清中IgE水平明顯低于對照組(P<0.05)；抗C5aR抗體組IgE水平較模型組明顯升高(P<0.05)；抗C5aR抗體+Jagged1組IgE水平高于抗C5aR抗體組(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠血清IgE水平比較

2.34組大鼠血清IFN-γ、IL-6、IL-10和IL-17水平比較 與對照組比較，模型組血清IFN-γ、IL-10水平明顯下降，IL-6、IL-17水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，抗C5aR抗體組IFN-γ、IL-10水平明顯升高，而IL-6、IL-17水平明顯下降(P<0.05)；與抗C5aR抗體組比較，抗C5aR抗體+Jagged1組IFN-γ、IL-10水平明顯下降，同時IL-6、IL-17水平明顯升高(P<0.05)，見圖1。

注：A～D分別為4組IFN-γ、IL-6、IL-10和IL-17水平比較；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與抗C5aR抗體組比較，&P<0.05。

2.44組大鼠鼻腔黏膜組織病理學(xué)變化比較 HE染色和PAS染色結(jié)果顯示，對照組大鼠鼻腔黏膜組織結(jié)構(gòu)整齊、排列有序，未發(fā)現(xiàn)組織損傷；模型組大鼠鼻腔黏膜組織可見明顯的血管擴(kuò)張、水腫和嚴(yán)重炎性細(xì)胞浸潤，嗜酸性細(xì)胞粒數(shù)目和杯狀細(xì)胞數(shù)目均明顯增加；抗C5aR抗體組鼻腔黏膜組織仍有水腫，相較于模型組炎癥細(xì)胞浸潤程度減輕，嗜酸性細(xì)胞粒數(shù)目和杯狀細(xì)胞數(shù)目均減少；而與抗C5aR抗體組相比較，抗C5aR抗體+Jagged1組鼻腔黏膜組織水腫和炎性細(xì)胞浸潤較為嚴(yán)重，嗜酸性細(xì)胞粒數(shù)目和杯狀細(xì)胞數(shù)目也表現(xiàn)為增加，見圖2。

注：A為對照組大鼠鼻腔黏膜組織HE染色,B為模型組大鼠鼻腔黏膜組織HE染色,C為抗C5aR抗體組大鼠鼻腔黏膜組織HE染色,D為抗C5aR抗體+Jagged1組大鼠鼻腔黏膜組織HE染色,E為對照組大鼠鼻腔黏膜組織PAS染色,F為模型組大鼠鼻腔黏膜組織PAS染色,G為抗C5aR抗體組大鼠鼻腔黏膜組織PAS染色,H為抗C5aR抗體+Jagged1組大鼠鼻腔黏膜組織PAS染色。

2.54組大鼠鼻腔黏膜組織RORγt與Foxp3表達(dá)比較 Western blot檢測結(jié)果顯示，模型組鼻腔黏膜組織中RORγt蛋白表達(dá)較對照組明顯上調(diào)，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)則明顯下調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，抗C5aR抗體組RORγt蛋白表達(dá)明顯下調(diào)、Foxp3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；而相較于抗C5aR抗體組，抗C5aR抗體+Jagged1組RORγt蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖3。

注：A為對照組，B為模型組，C為抗C5aR抗體組，D為抗C5aR抗體+Jagged1組。

2.64組大鼠外周血Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞亞群比例分析 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組外周血中Th17細(xì)胞比例升高，Treg 細(xì)胞比例降低，Th17/Treg比值明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，抗C5aR抗體組Th17細(xì)胞比例降低而Treg 細(xì)胞比例升高，Th17/Treg比值明顯下降(P<0.05)；而相較于抗C5aR抗體組，抗C5aR抗體+Jagged1組Th17細(xì)胞比例升高，Treg細(xì)胞比例降低，同時，Th17/Treg比值明顯增加(P<0.05)，見圖4。

注： A為對照組大鼠外周血中Th17細(xì)胞比例,B為模型組大鼠外周血中Th17細(xì)胞比例,C為抗C5aR抗體組大鼠外周血中Th17細(xì)胞比例,D為抗C5aR抗體+Jagged1組大鼠外周血中Th17細(xì)胞比例,E為對照組大鼠外周血Treg 細(xì)胞比例,F為模型組大鼠外周血Treg 細(xì)胞比例,G為抗C5aR抗體組大鼠外周血Treg 細(xì)胞比例,H為抗C5aR抗體+Jagged1組大鼠外周血Treg 細(xì)胞比例。

2.74組大鼠鼻腔黏膜組織Notch1-Jagged1信號途徑相關(guān)蛋白表達(dá)比較 通過免疫組織化學(xué)染色結(jié)果可觀察到，對照組鼻腔黏膜組織中染色較淺，Notch1蛋白陽性表達(dá)率為(8.50%±0.66%)；模型組中染色較深，Notch1蛋白陽性表達(dá)率為(38.03%±3.15%)，較對照組明顯增加(P<0.05)；抗C5aR抗體組中染色明顯變淺，Notch1蛋白陽性表達(dá)率為(8.47%±0.70%)，較模型組明顯降低(P<0.05)；而抗C5aR抗體+Jagged1組染色又明顯加深，Notch1蛋白陽性表達(dá)率為(43.55%±3.89%)，相較于抗C5aR抗體組明顯增加(P<0.05)，見圖5。

注：A為對照組大鼠鼻腔黏膜組織Notch1蛋白染色，B為模型組大鼠鼻腔黏膜組織Notch1蛋白染色，C為抗C5aR抗體組大鼠鼻腔黏膜組織Notch1蛋白染色，D為抗C5aR抗體+Jagged1組大鼠鼻腔黏膜組織Notch1蛋白染色。

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組鼻腔黏膜組織中Notch1與Jagged1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，抗C5aR抗體組鼻腔黏膜組織中Notch1與Jagged1蛋白表達(dá)則明顯下降(P<0.05)；而抗C5aR抗體+Jagged1組Notch1與Jagged1蛋白表達(dá)較抗C5aR抗體組則明顯升高(P<0.05)，見圖6。

注：A為對照組，B為模型組，C為抗C5aR抗體組，D為抗C5aR抗體+Jagged1組。

3 討 論

AR是由IgE介導(dǎo)的與過敏原免疫反應(yīng)相關(guān)的鼻黏膜炎癥疾病，AR患者通常以鼻塞、打噴嚏和鼻癢等癥狀為主要特征。在AR反應(yīng)中，當(dāng)過敏原與鼻腔黏膜接觸后，肥大細(xì)胞通過分泌釋放炎性介質(zhì)如組胺、IL等，誘導(dǎo)急性過敏反應(yīng)的發(fā)生；當(dāng)在過敏原中持續(xù)暴露6～10 h后，鼻腔中會引發(fā)炎性細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，嗜酸性粒細(xì)胞來源的介質(zhì)誘導(dǎo)上皮損傷并致使鼻腔黏膜腫脹[9]。如今，AR已影響全球10%～20%成年人的健康[3]，因此，了解AR的性質(zhì)是改善該疾病的有效途徑。本研究使用OVA和Al(OH)3誘導(dǎo)構(gòu)建大鼠AR模型，在經(jīng)過抗C5aR抗體治療后發(fā)現(xiàn)，AR大鼠炎性反應(yīng)及鼻腔黏膜組織病變現(xiàn)象均得到了明顯改善。

補(bǔ)體系統(tǒng)是人體重要的免疫防御系統(tǒng)，活化后參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，包括癌癥、炎癥及自身免疫性疾病等。該系統(tǒng)主要由血漿蛋白與膜蛋白組成，級聯(lián)反應(yīng)的激活通過3個主要途徑的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)發(fā)生：經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑，這些途徑啟動后最終形成C3、C5轉(zhuǎn)換酶并產(chǎn)生過敏毒素C3a、C5a，它們主要通過與其相應(yīng)的受體C3aR和C5aR結(jié)合來發(fā)揮作用[10]。其中，補(bǔ)體成分C5a是主要的促炎介質(zhì)，該活性片段可激活中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞，合成并釋放炎性介質(zhì)而致使炎性反應(yīng)的發(fā)生，其特異性受體C5aR也在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá)。研究表明，C5a/C5aR相互作用導(dǎo)致中性粒細(xì)胞募集和巨噬細(xì)胞積累，并加劇多種炎癥反應(yīng)性疾病[11-12]。而以C5aR作為靶點開發(fā)補(bǔ)體C5aR單克隆抗體可有效治療其介導(dǎo)的疾病。如抗C5aR抗體聯(lián)合大蒜素對大鼠炎性腸病具有較好的治療效果，可抑制炎性反應(yīng)，提高動物生存率[13]。本研究結(jié)果顯示，抗C5aR抗體對AR大鼠也有良好的治療效果。

Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞是人類免疫系統(tǒng)的重要組成部分。Th17細(xì)胞代表促炎性T細(xì)胞的子集，可促進(jìn)組織損傷和自身免疫病理損傷。IL-17是Th17細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)作用的主要細(xì)胞因子。相比之下，Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用，其功能障礙可能誘發(fā)自身免疫性疾病[14]。在生理條件下，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞在動態(tài)平衡中互相拮抗，并參與維持機(jī)體正常的免疫狀態(tài)。當(dāng)Treg細(xì)胞數(shù)量減少或Th17細(xì)胞數(shù)量增加時，Th17/Treg失衡并誘導(dǎo)炎性反應(yīng)[15-16]。本研究結(jié)果顯示，AR發(fā)生后大鼠機(jī)體內(nèi)Th17/Treg失衡，在經(jīng)過抗C5aR抗體治療后Th17/Treg趨于平衡狀態(tài)。

Notch信號傳導(dǎo)是一個保守且特征明確的途徑，在動物發(fā)育、維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并介導(dǎo)細(xì)胞增殖、發(fā)育及分化。在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)了Notch信號的4個受體(Notch1～4)和5個配體(Jagged1～2和Delta-like 1、3、4)。Notch受體與其配體結(jié)合后，Notch信號通路被激活并催化Notch受體，導(dǎo)致Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(N-ICD)的釋放。接著，N-ICD易位到細(xì)胞核中，并與共激活因子結(jié)合以介導(dǎo)下游基因的表達(dá)[17-18]。以往研究表明，Notch1-Jagged1信號途徑在AR中被激活，Notch1可通過抑制Treg 細(xì)胞分化而調(diào)節(jié)Foxp3表達(dá)[19]。本研究結(jié)果同樣顯示，AR大鼠鼻腔黏膜組織中Notch1與Jagged1蛋白表達(dá)明顯升高，使用抗C5aR抗體治療后，組織內(nèi)Notch1與Jagged1蛋白表達(dá)均下降。為了進(jìn)一步驗證抗C5aR抗體是否通過Notch1-Jagged1信號途徑發(fā)揮作用，筆者通過聯(lián)合使用抗C5aR抗體與Jagged1肽作用后發(fā)現(xiàn)其對AR大鼠未起到改善作用。由此推測，抗C5aR抗體可能通過調(diào)控Notch1-Jagged1信號途徑在AR中發(fā)揮作用。

綜上所述，抗C5aR抗體可能通過減輕炎性反應(yīng)，調(diào)控RORγt與Foxp3蛋白表達(dá)，介導(dǎo)Th17/Treg平衡及抑制Notch1-Jagged1信號途徑激活，從而對AR大鼠的癥狀起到一定的改善作用。然而，Notch信號通路與Hedgehog、Wnt、NF-κB、AKT/mTOR等多個信號通路交互作用參與細(xì)胞、組織、器官的分化與發(fā)育過程，在本研究中，給予Notch信號傳導(dǎo)途徑配體的Jagged1肽作用，是直接還是間接與抗C5aR抗體治療產(chǎn)生拮抗作用還有待后續(xù)進(jìn)行深入探究。