馬海霞，李 春，宋 娟，李 莉

1.上海市長(zhǎng)寧區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科，上海200051；2.銀川市婦幼保健院檢驗(yàn)科，寧夏銀川 750001;3.銀川市婦幼保健院產(chǎn)科，寧夏銀川 750001

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)優(yōu)生優(yōu)育越來(lái)越重視。我國(guó)是人口大國(guó)，也是出生缺陷和殘疾高發(fā)國(guó)家[1-2]。2018年《關(guān)于印發(fā)全國(guó)出生缺陷綜合防治方案的通知》[1]中指出，我國(guó)每年出生缺陷胎兒高達(dá)90萬(wàn)人，占全年出生人口的5.6%，出生缺陷已成為影響國(guó)民素質(zhì)的重大公共衛(wèi)生問題。因此，實(shí)施出生缺陷臨床產(chǎn)前篩查和診斷存在必要性，其能夠使胎兒畸形盡早診斷出來(lái)，進(jìn)而及時(shí)干預(yù)，減少出生缺陷的發(fā)生，提升人口素質(zhì)[3-4]。本文通過優(yōu)化和有效整合多種產(chǎn)前篩查和診斷檢測(cè)方法，對(duì)比研究孕期產(chǎn)前篩查和診斷多技術(shù)優(yōu)化整合模式在預(yù)防胎兒出生缺陷中的應(yīng)用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取在銀川市婦幼保健院(以下簡(jiǎn)稱本院)產(chǎn)前診斷中心門診就診的孕婦，結(jié)合具體臨床情境及本院現(xiàn)有開展技術(shù)的實(shí)際情況，優(yōu)化和有效整合多種產(chǎn)前篩查和診斷技術(shù)，包括產(chǎn)前超聲檢查、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)、血清學(xué)篩查、染色體核型分析、染色體微陣列技術(shù)等，制訂針對(duì)不同孕婦的個(gè)體化產(chǎn)前篩查和診斷模式，把就診孕婦分為優(yōu)化整合組和未優(yōu)化整合組。所有納入者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2分組標(biāo)準(zhǔn) 優(yōu)化整合組：就診適齡孕婦一般在孕11～13+6周行胎兒頸部透明帶厚度(NT)檢測(cè)，NT≥3.0 mm孕婦建議選擇介入性產(chǎn)前診斷；NT檢測(cè)(NT<3.0 mm)聯(lián)合孕早中期血清學(xué)篩查，評(píng)估結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦建議選擇介入性產(chǎn)前診斷；評(píng)估結(jié)果為臨界風(fēng)險(xiǎn)的孕婦建議選擇NIPT，而NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦建議選擇介入性產(chǎn)前診斷；血清學(xué)篩查低風(fēng)險(xiǎn)及NIPT低風(fēng)險(xiǎn)孕婦建議中晚孕期定期產(chǎn)檢及隨訪。高齡、不良孕產(chǎn)史、夫婦一方染色體異常、超聲軟指標(biāo)異常的孕婦結(jié)合具體臨床情境及本院現(xiàn)有開展技術(shù)的實(shí)際情況可選擇介入性產(chǎn)前診斷。所有孕婦均于孕22～24周進(jìn)行Ⅲ級(jí)超聲檢查。本研究中選取按以上流程進(jìn)行規(guī)范系統(tǒng)產(chǎn)檢的就診孕婦6 845例為優(yōu)化整合組。

未優(yōu)化整合組：就診孕婦未進(jìn)行規(guī)范系統(tǒng)產(chǎn)檢而在基層醫(yī)院隨機(jī)產(chǎn)檢；或在不具備產(chǎn)前診斷資質(zhì)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)只做Ⅰ級(jí)超聲檢查，未做NT檢測(cè)或孕早期血清學(xué)篩查；醫(yī)生未充分告知以及個(gè)人原因錯(cuò)失檢查時(shí)機(jī)；而孕中期來(lái)本院只進(jìn)行孕中期血清學(xué)篩查或介入性產(chǎn)前診斷或Ⅲ級(jí)超聲檢查等。本研究中選取只進(jìn)行孕中期血清學(xué)篩查或羊水染色體核型分析或Ⅲ級(jí)超聲檢查就診孕婦6 413例為未優(yōu)化整合組。

1.2方法

1.2.1孕期超聲檢查 胎兒結(jié)構(gòu)異常的超聲篩查規(guī)范采用國(guó)際婦產(chǎn)科超聲學(xué)會(huì)(ISUOG)和英國(guó)胎兒醫(yī)學(xué)基金會(huì)(FMF)建議使用的孕早期胎兒解剖結(jié)構(gòu)檢查橫切法及軟指標(biāo)項(xiàng)目的掃查，包括孕早期NT檢測(cè)及孕中期Ⅲ級(jí)超聲檢查[5-6]。

1.2.2孕早中期血清學(xué)篩查 抽取孕婦空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血5 mL，靜置30 min，3 000 r/min離心6 min，取血清，置于-20 ℃環(huán)境下保存?zhèn)溆?。采用鉑金埃爾默公司生產(chǎn)的全自動(dòng)時(shí)間分辨免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行產(chǎn)前血清學(xué)篩查，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)操作程序執(zhí)行檢測(cè)步驟。篩查方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)在Lifecycle軟件中輸入妊娠患者年齡、體質(zhì)量、孕周等臨床資料信息，計(jì)算血清甲胎蛋白(AFP)、游離雌三醇(uE3)及人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)等的中位數(shù)值(MoM值)[7]。經(jīng)B超測(cè)定胎頭雙頂徑評(píng)估孕齡后結(jié)合孕婦的年齡及體質(zhì)量，通過評(píng)估軟件計(jì)算出21-三體綜合征、18-三體綜合征、開放性神經(jīng)管缺陷的“危險(xiǎn)系數(shù)”。

1.2.3NIPT 采集孕婦靜脈血10 mL，離心分離血漿，提取血漿游離DNA、構(gòu)建文庫(kù)、文庫(kù)定量、高通量測(cè)序機(jī)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析，計(jì)算出13、18、21 3條染色體和其他染色體Z值。利用Z值進(jìn)行生物學(xué)信息分析來(lái)評(píng)估標(biāo)本13-三體綜合征、18-三體綜合征、21-三體綜合征及性染色體異常是否為高風(fēng)險(xiǎn)。

1.2.4染色體核型分析 嚴(yán)格無(wú)菌操作B超定位經(jīng)腹壁行羊膜腔穿刺術(shù)，分裝于兩支15 mL離心管中，800 r/min離心10 min后，留取1.0～1.5 mL沉淀，加5 mL培養(yǎng)基混勻后，分別接種于兩瓶25 cm2的羊水培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)7 d后換液，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛可見大量克隆時(shí)，加入濃度為10 μg/mL的秋水仙素60 μL，作用3.5～4.0 h后收獲細(xì)胞進(jìn)行核型分析，必要時(shí)可進(jìn)行傳代培養(yǎng)收獲細(xì)胞。核型分析按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN2016)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析診斷。

1.2.5染色體微陣列(CMA)技術(shù) 送10 mL羊水轉(zhuǎn)運(yùn)至北京貝康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，采用美國(guó)Thermo公司的Cytoscan 750K芯片掃描，檢測(cè)流程包括消化、連接、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物純化、片段化處理，以及標(biāo)記、探針雜交、洗染掃描等過程。芯片檢測(cè)信息的分析和判讀使用Chromosome Analysis Suite(ChAS)2.1軟件，同時(shí)結(jié)合目前國(guó)際上常用的基因組與表型公共數(shù)據(jù)庫(kù)[加州大學(xué)圣克魯茲分?；蚪M瀏覽器數(shù)據(jù)庫(kù)(UCSC Genome Browser，http:// genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)、臨床基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(ClinGene，http://www.clinicalgenome.org)、基于Ensembl資源建立的人類染色體不平衡和表型數(shù)據(jù)庫(kù)(DECIPHER，https://decipher.sanger.ac.uk)、基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù)(DGV，http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM，http://www.omim.org)和公共醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(PubMed，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)]進(jìn)行檢索和判讀。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1優(yōu)化整合組與未優(yōu)化整合組異常檢出率比較 優(yōu)化整合組異常檢出率高于非優(yōu)化整合組(χ2=17.554，P<0.05)。見表1。

表1 優(yōu)化整合組與未優(yōu)化整合組異常檢出率比較

2.2優(yōu)化整合組與未優(yōu)化整合組出生缺陷發(fā)生率比較 優(yōu)化整合組出生缺陷發(fā)生率低于非優(yōu)化整合組(χ2=9.297，P<0.05)。見表2。

表2 優(yōu)化整合組與未優(yōu)化整合組出生缺陷發(fā)生率比較

2.3優(yōu)化整合組和未優(yōu)化整合組出生缺陷胎兒類型和例數(shù)比較 優(yōu)化整合組中，行NT評(píng)估5 513例，NT≥3 mm 113例，行孕早中期血清學(xué)篩查5 400例，行NIPT 2 194例，經(jīng)產(chǎn)前診斷確診陽(yáng)性9例，其中21-三體綜合征8例，性染色體異常1例，異常檢出率為0.41%。羊水染色體核型分析937例，非整倍體及嵌合體和性染色體異常39例，異常檢出率為4.16%；CMA檢測(cè)59例，異常12例，異常檢出率20.34%；Ⅲ級(jí)超聲檢查6 845例，異常310例，異常檢出率4.53%(神經(jīng)系統(tǒng)畸形40例、胎兒顏面畸形22例、消化系統(tǒng)畸形17例、胎兒心臟異常66例、胎兒胸腔異常10例、胎兒腹裂畸形3例、泌尿系統(tǒng)異常26例、胎兒腫瘤10例、非免疫性水腫23例、胎兒附屬物13例、肌肉骨骼及肢體異常30例、多發(fā)畸形50例。

未優(yōu)化整合組中，行孕中期血清學(xué)篩查5 203例；羊水染色體核型分析659例，非整倍體及嵌合體和性染色體異常25例，異常檢出率為3.79%；Ⅲ級(jí)超聲檢查762例，異常216例，異常檢出率為28.35%。優(yōu)化整合組和未優(yōu)化整合組出生缺陷胎兒的類型及例數(shù)見表3。

表3 優(yōu)化整合組和未優(yōu)化整合組出生缺陷胎兒類型和例數(shù)比較(n)

3 討 論

孕早期篩查包括超聲測(cè)定NT，NT是胎兒頸后皮膚至皮下軟組織之間無(wú)回聲的最大厚度，一般在孕11～13+6周進(jìn)行篩查。NT正常值應(yīng)小于3 mm，有的醫(yī)院選取以小于2.5 mm為界限。孕早期篩查還包括母體血清學(xué)篩查，以及胎齡(以胎兒頂臀長(zhǎng)計(jì)量)聯(lián)合妊娠相關(guān)血漿蛋白-A(PAPP-A)、總或游離β-hCG等血清學(xué)指標(biāo)的測(cè)定。孕早期篩查結(jié)果呈高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，可行絨毛膜穿刺術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷。孕早期篩查的開展不但可以將異常檢出的孕周提前，還可以獲得更好的篩查檢出效率，在5%假陽(yáng)性率的水平下，孕早期篩查異常檢出率可達(dá)到85%左右[8]。但由于本院絨毛膜穿刺術(shù)還未開展，因此NT檢測(cè)聯(lián)合孕早期血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦行羊水穿刺進(jìn)行產(chǎn)前診斷或者轉(zhuǎn)診到其他產(chǎn)前診斷中心。孕中期血清學(xué)篩查通過測(cè)定孕15～20周母親血清中AFP、uE3及β-hCG水平，經(jīng)超聲測(cè)定胎頭雙頂徑評(píng)估孕齡后結(jié)合孕婦的年齡和體質(zhì)量計(jì)算出“危險(xiǎn)系數(shù)”。而單純的孕中期血清學(xué)篩查存在篩查效率較低、異常檢出孕周較晚的問題[9]。本研究中未優(yōu)化整合組部分病例即是行單純的孕中期血清學(xué)篩查而導(dǎo)致出生缺陷胎兒的漏篩。NIPT是在孕12周后抽取孕婦靜脈血，對(duì)血漿中游離DNA片段(包含胎兒游離DNA片段)進(jìn)行高通量測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息分析，從中得到胎兒的遺傳信息，從而準(zhǔn)確檢測(cè)21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征等。對(duì)于胎兒21-三體綜合征和18-三體綜合征來(lái)說，異常檢出率大于98%，假陽(yáng)性率在5‰以下；當(dāng)假陽(yáng)性率在5‰以下時(shí)，對(duì)13-三體綜合征的異常檢出率也達(dá)90%以上[10]。雖然該方法對(duì)于胎兒常見染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)提示較準(zhǔn)確，但仍然存在假陽(yáng)性和假陰性的可能，因此臨床應(yīng)用定位應(yīng)為產(chǎn)前篩查而非產(chǎn)前診斷。本研究中優(yōu)化整合組中行NIPT 2 194例，經(jīng)染色體核型分析產(chǎn)前診斷異常檢出9例，其中21-三體綜合征8例，性染色體異常1例，提示NIPT對(duì)于非整倍體異常篩查效能及異常檢出率均尚可。以上檢測(cè)技術(shù)屬于產(chǎn)前篩查技術(shù)，多技術(shù)優(yōu)化整合應(yīng)用可以提高出生缺陷檢出率，但是不能代替產(chǎn)前診斷技術(shù)。

介入性產(chǎn)前診斷技術(shù)包括絨毛膜穿刺術(shù)、羊膜腔穿刺術(shù)和臍血穿刺術(shù)，本院僅開展羊膜腔穿刺術(shù)。羊膜腔穿刺術(shù)抽取羊水細(xì)胞培養(yǎng)做染色體核型分析，用以診斷21-三體綜合征、18-三體綜合征等重大出生缺陷，其準(zhǔn)確性高，技術(shù)成熟穩(wěn)定，是染色體病產(chǎn)前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，羊水染色體核型分析在制片所能達(dá)到的顯帶分辨率(如G帶500條帶范圍內(nèi))對(duì)染色體異常的診斷是全息性的，除能夠檢測(cè)染色體非整倍體外還能夠檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)改變。本研究?jī)?yōu)化整合組中行羊水染色體核型分析937例，非整倍體及嵌合體和性染色體異常39例，異常檢出率為4.16%，而未優(yōu)化整合組行羊水染色體核型分析659例，非整倍體及嵌合體和性染色體異常25例，異常檢出率為3.79%，異常檢出率低于優(yōu)化整合組，提示孕期產(chǎn)前篩查和診斷多技術(shù)優(yōu)化整合模式能提高出生缺陷胎兒的檢出率。而CMA技術(shù)是以微陣列為技術(shù)基礎(chǔ)的基因組拷貝數(shù)分析技術(shù)，主要包括微陣列比較基因組雜交(aCGH)和單核苷酸多態(tài)性技術(shù)(SNP)的微陣列。CMA技術(shù)具有高靈敏度和高特異度的優(yōu)勢(shì)，其能夠提供大量有臨床價(jià)值的信息，大大提高了遺傳異常疾病的檢出率。染色體異常包括染色體數(shù)目異常和染色體結(jié)構(gòu)異常，臨床上常見的染色體疾病包括21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征、Turner綜合征、克氏綜合征、超雌綜合征、超雄綜合征等[11]。而CMA技術(shù)可穩(wěn)定檢出<10 Mb的小片段拷貝數(shù)變異，是羊水染色體核型分析的有效補(bǔ)充，有助于檢出有染色體疾病的胎兒，在明確異常來(lái)源的前提下既可以避免出生缺陷的發(fā)生，也可以進(jìn)行再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估，以便指導(dǎo)生育。本研究?jī)?yōu)化整合組中CMA技術(shù)檢測(cè)59例，異常12例，異常檢出率20.33%，有效預(yù)防了出生缺陷的發(fā)生。本研究中優(yōu)化整合組出生缺陷發(fā)生率低于非優(yōu)化整合組，提示孕期產(chǎn)前篩查和診斷多技術(shù)優(yōu)化整合模式能明顯降低出生缺陷的發(fā)生率。

本研究中優(yōu)化整合組異常檢出率高于未優(yōu)化整合組，且出生缺陷發(fā)生率低于未優(yōu)化整合組。由于以往的篩查和診斷策略只是針對(duì)不同的研究方法而使其達(dá)到最高的陽(yáng)性率和最低的陰性率，但沒有把各種不同的方法有效整合起來(lái)，為患者制訂最有效、最便捷、最具性價(jià)比的產(chǎn)前篩查和診斷方案。本研究在現(xiàn)有能開展的產(chǎn)前篩查和診斷技術(shù)的條件下，將產(chǎn)前超聲檢查、血清學(xué)篩查、NIPT、染色體疾病診斷、細(xì)胞遺傳及分子遺傳學(xué)檢測(cè)及遺傳咨詢?cè)谝粋€(gè)平臺(tái)下有效優(yōu)化整合，結(jié)合具體臨床情境制訂個(gè)體化的最佳診療方案，將傳統(tǒng)優(yōu)生醫(yī)學(xué)與基因組學(xué)融合，建立更為完善的孕期篩查和診斷的新模式，以實(shí)現(xiàn)最大化的臨床服務(wù)，并能夠有效減少出生缺陷的發(fā)生。