韓心遠(yuǎn)，高小娟，韋潔宏，熊 丹，張秀明

深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518001

肺部感染是指由多種病原體引起的終末氣道、肺泡腔和肺間質(zhì)感染，常表現(xiàn)為呼吸困難、發(fā)熱、咳嗽、咳痰等癥狀[1]。臨床上針對(duì)器官移植、癌癥治療等通常會(huì)使用大劑量的免疫抑制劑，導(dǎo)致患者抵抗力下降，極易引發(fā)肺部感染。在重癥監(jiān)護(hù)病房，患者術(shù)后護(hù)理不當(dāng)，機(jī)械侵入性檢查或治療同樣極大地增加了肺部感染的可能性。此類患者往往病情發(fā)展快，預(yù)后差，且多為混合感染，快速精準(zhǔn)的病原學(xué)診斷直接決定了患者的預(yù)后[2-4]。目前，臨床常規(guī)開展的傳統(tǒng)微生物鑒定手段(培養(yǎng)、涂片等)時(shí)間長且精度不夠，對(duì)臨床指導(dǎo)價(jià)值非常有限。近年來，無偏倚、通量高的宏基因組測序(mNGS)技術(shù)有效地助力了肺部疑難感染的病原學(xué)診斷。本研究采用mNGS檢測肺部感染患者痰液中的病原微生物，探討痰液宏基因組測序在肺部感染中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 以2020年7月至2021年7月深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)重癥醫(yī)學(xué)科、兒科、呼吸內(nèi)科重癥肺部感染患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)出現(xiàn)胸痛、咳嗽、咳痰等癥狀；(2)體溫超過38 ℃；(3)經(jīng)血常規(guī)檢查，白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯上升；(4)肺部有濕啰音；(5)胸部X線檢查顯示有肺部炎性改變。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則。共納入22例患者，其中男10例(45.5%)，女12例(54.5%)；年齡0～86歲；重癥醫(yī)學(xué)科患者11例，兒科患者3例，呼吸內(nèi)科患者8例。所有患者均行微生物培養(yǎng)及mNGS檢測。

1.2痰液標(biāo)本的收集 可自主咳痰患者清晨清水漱口3次后,用力咳出1～2口痰(勿將唾液和鼻后分泌物當(dāng)作痰送檢)于無菌痰杯內(nèi)。無痰或咳嗽少痰患者,先刷牙(口腔黏膜、舌頭和牙齦)，勿用牙膏，后用3～5 mL 3%NaCl超聲霧化后留痰。嬰幼兒患者，清洗口腔后，拍背或刺激咳嗽，用一次性無菌吸痰管，在嚴(yán)格無菌操作下，負(fù)壓吸取下呼吸道痰液。每一份標(biāo)本的留取量應(yīng)>1 mL，標(biāo)本收集后立即分裝至無菌、干燥、潔凈的痰杯內(nèi)，并于2 h內(nèi)室溫送檢。

1.3方法 所有標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行mNGS和微生物培養(yǎng)檢測。微生物培養(yǎng)方法參照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第4版[5]對(duì)痰液進(jìn)行質(zhì)量篩查。合格的標(biāo)本分區(qū)劃線接種于血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、麥康凱平板。置5%～10% CO2環(huán)境中，(35±2)℃培養(yǎng)18～24 h。所獲菌株經(jīng)人工及microflex LT/SH全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(德國布魯克公司)鑒定。mNGS檢測包括DNA和RNA兩部分的檢測。RNA檢測部分需將宿主細(xì)胞核糖體RNA去除，以提高RNA病毒的檢測靈敏度?？偤怂崽崛『?，利用隨機(jī)引物建庫，PCR擴(kuò)增出標(biāo)本中的所有微生物，最后對(duì)擴(kuò)增片段的序列進(jìn)行測定和比對(duì)，鑒定出具體的微生物種類，隨后去宿主化以消除正常的人類微生物群落背景，從而找到所檢測臨床標(biāo)本中可能致病的微生物。mNGS技術(shù)主要檢測指標(biāo)為從微生物中讀取到的特異核酸read數(shù)目，read數(shù)目與該病原體含量呈正相關(guān)。若是定植微生物，read數(shù)目含量不會(huì)太高。兩種檢測方法結(jié)果一致性比較：當(dāng)微生物培養(yǎng)與mNGS檢測出完全相同的病原體，認(rèn)為結(jié)果完全一致；檢測結(jié)果部分相同，認(rèn)為結(jié)果部分一致；檢測結(jié)果完全不同，認(rèn)為結(jié)果不一致。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1mNGS與微生物培養(yǎng)結(jié)果比較 兩種檢測方法結(jié)果顯示，15例mNGS與微生物培養(yǎng)均為陽性，陽性符合率為93.8%；2例mNGS與微生物培養(yǎng)均為陰性，陰性符合率為33.3%；總符合率為77.3%。見表1。

表1 mNGS和微生物培養(yǎng)結(jié)果比較

2.2兩種檢測方法檢出不同種類病原體結(jié)果比較 在22例肺部感染患者中，兩種檢測方法病毒檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，mNGS檢測出4種病毒，分別是呼吸道合胞病毒B型、人皰疹病毒1型、人皰疹病毒4型及人皰疹病毒6B型。微生物培養(yǎng)常見鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌，mNGS檢測結(jié)果中常見肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、白假絲酵母菌及人皰疹病毒，兩種檢測方法對(duì)細(xì)菌和真菌檢出率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩種檢測方法檢出不同種類病原體結(jié)果比較 [n(%)]

2.3兩種檢測方法病原體檢出種類數(shù)比較 在22例肺部感染患者中，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)在多數(shù)情況下只能培養(yǎng)出1種病原菌。兩種檢測方法對(duì)1種及>2種病原體的檢出率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩種檢測方法病原體檢出種類數(shù)比較[n(%)]

2.4兩種檢測方法結(jié)果一致性比較 在兩種檢測方法結(jié)果完全一致的病原體中，2例微生物培養(yǎng)和mNGS檢測均為陰性，2例微生物培養(yǎng)和mNGS結(jié)果均為陽性且一致(鮑曼不動(dòng)桿菌1例，銅綠假單胞菌1例)。在兩種檢測方法結(jié)果不一致的病原體中，3例微生物培養(yǎng)陰性，mNGS檢測陽性(肺炎鏈球菌2例、延長奈瑟菌1例、金黃色葡萄球菌和流感嗜血桿菌混合感染1例)，1例mNGS檢測陰性，微生物培養(yǎng)陽性(鮑曼不動(dòng)桿菌和嗜麥芽窄食單胞菌混合感染1例)。見表4。

表4 兩種檢測方法結(jié)果一致性比較[n(%)]

3 討 論

肺部感染是全球發(fā)病率最高的感染性疾病，對(duì)全球造成的疾病負(fù)擔(dān)極其沉重[6-7]。由于該類感染涉及的病原體眾多，多數(shù)醫(yī)生在無法進(jìn)行準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷前常采用經(jīng)驗(yàn)治療[8]，不明病原體與混合感染往往導(dǎo)致經(jīng)驗(yàn)性治療效果不佳。快速、準(zhǔn)確找到病原體，給予敏感藥物進(jìn)行精準(zhǔn)治療，提高疾病治療效果，改善不良預(yù)后，是臨床醫(yī)生迫切需要解決的問題[9-10]。

盡管傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)是檢測病原菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但對(duì)于肺部感染其檢出率僅為10%左右[11]，而PCR檢測雖然在特異度、靈敏度和檢測時(shí)效上明顯優(yōu)于微生物培養(yǎng)，但因?yàn)镻CR檢測是基于已知的病原體基因組進(jìn)行測序鑒定，所能提供的信息依然不能解決臨床微生物診斷檢出率低的問題。因此，對(duì)于未知病原體和混合感染的檢測是傳統(tǒng)檢測方法難以逾越的障礙。無偏倚的mNGS與傳統(tǒng)檢測方法相比，無需培養(yǎng)，病原體覆蓋度廣，靈敏度高，有利于鑒定不明病原體和混合感染[9,12]。研究發(fā)現(xiàn)，在肺部感染性疾病中，mNGS檢測的檢出率均高于傳統(tǒng)檢測方法，在細(xì)菌檢測方面尤為突出[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在肺部感染中，mNGS檢測對(duì)細(xì)菌的檢出率略高于微生物培養(yǎng)，但兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與近年研究結(jié)果不一致[13-14]，可能與本研究納入的檢測例數(shù)少有關(guān)。在混合感染方面，mNGS對(duì)1種及>2種病原體的檢出率明顯高于傳統(tǒng)檢測方法，提示mNGS檢測在混合感染的病原體檢測方面有巨大的優(yōu)勢。有研究指出，mNGS檢測可以在早期確定重癥肺部感染患者的病原體，幫助臨床醫(yī)生對(duì)患者進(jìn)行精準(zhǔn)治療，從而降低重癥肺炎患兒28 d和90 d的病死率[15]。本研究中，在mNGS與微生物培養(yǎng)結(jié)果不一致的病原體中，微生物培養(yǎng)陰性結(jié)果明顯多于mNGS陰性結(jié)果，也證明了mNGS檢測的優(yōu)越性。

mNGS對(duì)真菌、病毒等非細(xì)菌類病原體的鑒定具有固有的優(yōu)勢，對(duì)于一般病原體，mNGS的檢測閾值為0.01～130.00 CFU/mL，而微生物培養(yǎng)的檢測閾值為100.00～1 000.00 CFU/mL[16]。mNGS基于病原體基因序列進(jìn)行檢測，無需考慮其活性，對(duì)已接受廣譜抗菌藥物治療的患者，仍可借助mNGS技術(shù)進(jìn)行病原學(xué)檢測[17]。在本研究的檢測結(jié)果中，微生物培養(yǎng)常見鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌，mNGS檢測結(jié)果中常見肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、白假絲酵母菌及人皰疹病毒。

目前，臨床上傳統(tǒng)的病毒檢測方法主要為基于病毒基因的PCR技術(shù)和病毒抗原抗體的血清學(xué)檢測。但這些檢測方法需要提前預(yù)知病毒的基因序列或蛋白質(zhì)序列信息，因此對(duì)于不明、未知病毒則不能有效檢出，也難以快速進(jìn)行病毒分型。在本研究的mNGS檢測結(jié)果中共檢測出4種病毒，分別是呼吸道合胞病毒B型、人皰疹病毒1型、人皰疹病毒4型及人皰疹病毒6B型，利用mNGS可更加精確地檢測出病毒類型，以便臨床醫(yī)生對(duì)患者進(jìn)行精準(zhǔn)治療。

在mNGS的實(shí)際臨床應(yīng)用中，仍存在多個(gè)需要關(guān)注的問題。(1)受制備與純化技術(shù)本身的限制，試劑中可能普遍存在外源性核酸序列，且mNGS所檢測到的病原體序列也可能來自于正常的定植微生物群、標(biāo)本污染，而痰液標(biāo)本往往會(huì)含有部分上呼吸道及口腔微生物，因此需要檢驗(yàn)人員有效區(qū)分出感染微生物[18]。(2)病原體基因組數(shù)據(jù)庫不完善，目前還沒有囊括所有病原微生物的生物信息數(shù)據(jù)庫，有可能導(dǎo)致漏檢[19]。(3)mNGS技術(shù)已逐漸成熟，但還缺乏公認(rèn)的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)的指南，因此需要臨床醫(yī)生以科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度，并采用合理的方式將mNGS應(yīng)用于臨床。

本研究也存在一定局限性。首先，痰液作為臨床上常見的檢驗(yàn)標(biāo)本，有著取樣方便、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，但痰液的采樣合格率因人而異，且檢驗(yàn)結(jié)果易受口腔雜菌的影響，因此僅依賴痰液標(biāo)本行病原體診斷尚缺乏定論；其次，傳統(tǒng)檢測方法中，只利用微生物培養(yǎng)進(jìn)行病原體檢測，受限于培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)環(huán)境的限制，難以檢測出苛養(yǎng)菌，亦無法檢測出病毒。

綜上所述，在肺部感染患者的病原學(xué)診斷中，痰液mNGS相比傳統(tǒng)檢測方法有更高的檢出率，尤其是對(duì)病毒及混合感染的檢測更具有優(yōu)勢，可為肺部感染患者的臨床診治提供依據(jù)，有助于早期精準(zhǔn)地進(jìn)行臨床干預(yù)。