王 炎 王娟娟 楊 靜 郭含星 羅偉強(qiáng) 王曉衛(wèi)* 嚴(yán)興榮2，*

(1.陜西省動物研究所，西安，710032；2.陜西省野生動物保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安，710043；3.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安，710127；4.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心，西安，710032)

金絲猴(Rhinopithecus)共有5個(gè)亞種，其中4個(gè)亞種分布在中國。川金絲猴(Rh.roxellana)分布在四川、陜西、甘肅和湖北，黔金絲猴(Rh.brelichi)分布在貴州，滇金絲猴(Rh.bieti)和怒江金絲猴(Rh.strykeri)主要分布在云南，另外一個(gè)亞種越南金絲猴(Rh.avunculus)分布在越南和緬甸境內(nèi)[1]。川金絲猴屬于靈長目(Primates)猴科(Cercopithecidae)猶猴亞科(Colobinae)仰鼻猴屬，是亞洲特有種。由于人類活動范圍的擴(kuò)大，川金絲猴數(shù)量明顯減少，目前已被世界自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)列入瀕危物種紅色名錄瀕危等級(EN)，在我國被列入國家一級重點(diǎn)保護(hù)野生動物名錄[2-3]。為了保護(hù)這一瀕危物種，我國在川金絲猴分布的主要區(qū)域劃定了國家級自然保護(hù)區(qū)，如陜西周至國家級自然保護(hù)區(qū)、陜西佛坪國家級自然保護(hù)區(qū)、貴州梵凈山國家級自然保護(hù)區(qū)和湖北神農(nóng)架國家級自然保護(hù)區(qū)等。目前，我國對川金絲猴的保護(hù)主要是對其棲息地的保護(hù)，保證川金絲猴的基本活動范圍，以便其順利進(jìn)行種群繁衍。然而一些受傷、落單的川金絲猴很難回到原來的猴群，在野外難以生存，因此采取圈養(yǎng)的方式，以保護(hù)重要的遺傳資源[4]。為了擴(kuò)充人工圈養(yǎng)繁殖群體，早期多采用野外捕捉的方式，但圈養(yǎng)過程會導(dǎo)致野外川金絲猴產(chǎn)生不同程度的應(yīng)激，如妊娠后流產(chǎn)的比例增加[5]。應(yīng)激是機(jī)體受到外界刺激后，出現(xiàn)的保護(hù)自身的一種非特異性機(jī)制。應(yīng)激分急性和慢性應(yīng)激，急性應(yīng)激能引起動物神經(jīng)系統(tǒng)的精神障礙，表現(xiàn)為神經(jīng)興奮或抑制，內(nèi)分泌表現(xiàn)為腎上腺皮質(zhì)激素分泌的變化，尤其是皮質(zhì)醇的變化[6]。慢性應(yīng)激表現(xiàn)為多器官的功能異常，為了適應(yīng)外界刺激，保護(hù)動物機(jī)體，機(jī)體各器官、系統(tǒng)也在調(diào)整適應(yīng)慢性應(yīng)激，如免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等[7]。有研究表明，低溫慢性應(yīng)激影響西門塔爾牛(Simmental cattle)的免疫和抗氧化功能[8]；慢性應(yīng)激對大鼠的腸道和肝臟可產(chǎn)生損傷[9]。圈養(yǎng)川金絲猴生活的空間和環(huán)境受限制，且常與人類近距離接觸，長期處于慢性應(yīng)激狀態(tài)，如何減少應(yīng)激水平和評價(jià)應(yīng)激程度，是未來川金絲猴保護(hù)的一項(xiàng)重要工作。本研究通過提取川金絲猴糞便中的腸道細(xì)胞RNA，評價(jià)應(yīng)激和生殖激素的水平，探索腸道細(xì)胞RNA提取效率、皮質(zhì)醇和生殖激素水平的關(guān)系，為川金絲猴的保護(hù)提供理論和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 糞便采集

在川金絲猴的繁殖期(1月)，分別在樓觀臺野生動物救助站(該救助站有2個(gè)川金絲猴種群，約150只，采樣30只)和佛坪野生動物保護(hù)區(qū)(該保護(hù)區(qū)有5個(gè)川金絲猴種群，約500只，采樣其中一個(gè)種群中的45只)(表1)對不同年齡階段川金絲猴的新鮮糞便進(jìn)行多次采集，將采集后的糞便樣本置于50 mL無菌離心管內(nèi)，標(biāo)記后保存于盛有干冰的保溫盒中，帶至實(shí)驗(yàn)室后置于冰箱內(nèi)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 繁殖期川金絲猴的采樣信息

1.2 RNA提取及PCR擴(kuò)增

參考細(xì)胞RNA提取方法[10]，稱取0.2 g糞便，加液氮研磨后置于含有1 mL Trizol試劑的1.5 mL無菌eppendorf(EP)管中，漩渦震蕩1 min，-80 ℃過夜，漩渦震蕩30 s，加入200 μL氯仿，震蕩30 s，靜置10 min，10 000 r/min離心15 min，取上清液于無菌EP管中，分別用異丙醇和75%乙醇沉淀洗滌后溶于20 μL無菌水中，備用。PCR引物設(shè)計(jì)用Primer 5.0進(jìn)行，設(shè)計(jì)模板源于以往的檢測數(shù)據(jù)[11]，β-actin上游引物為5′-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3′，下游引物為5′-AGGTAGTCAGTCAGGTCCCG-3′。用PCR試劑盒對目的片段擴(kuò)增，分別加入模板、引物、2×Mix和水，在總體積為50 μL的條件下，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用GAPDH佐證，GAPDH上游引物為5′-TCCCTTTCGTAGGAGGGACT-3′，下游引物為5′-CTACTATGCCACCCCAGGAA-3′，反應(yīng)條件和擴(kuò)增程序同β-actin。

1.3 類固醇激素的提取

糞便類固醇的提取參考唐婕等[12]的方法。稱取0.5 g川金絲猴糞便，置于含有研磨球和5 mL 90%的甲醇離心管中，高速研磨5 min后，5 000 r/min離心10 min，取4 mL上清液于15 mL離心管中，待有沉淀析出后再用6 mL 90%的甲醇研磨5 min，取6 mL研磨液于相同的離心管中，60 ℃烘干，再取1 mL甲醇充分溶解，將甲醇溶液吸取置1.5 mL EP管中，60 ℃烘干，用100 μL甲醇再次溶解后放置于冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 孕酮、睪酮和皮質(zhì)醇激素的檢測

激素檢測用孕酮、睪酮和皮質(zhì)醇ELISA檢測試劑盒(均購自北京北方生物技術(shù)研究所)。檢測方法參考Ahuja-aguirre等[13]的研究。首先配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后將樣品按要求稀釋成稀釋樣品，將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、待測稀釋樣品加入96孔板的各孔中(每個(gè)樣本重復(fù)3次)；最后加入酶結(jié)合物和抗體各50 μL，震蕩混勻，貼上不干膠封條。樣品37 ℃孵育90 min，機(jī)器洗板，拍干孔中水分后，加入顯色液A和B各50 μL，37 ℃避光顯色15 min，每孔加入50 μL終止液，10 min內(nèi)在設(shè)定好的酶標(biāo)儀上用450 nm波長檢測OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出檢測濃度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有試驗(yàn)一式3份，數(shù)據(jù)用SPSS 13.0分析。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。通過配對t檢驗(yàn)比較分析，P<0.05判定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 圈養(yǎng)和野生川金絲猴糞便RNA提取效率

抽提川金絲猴的細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)過PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)全部個(gè)體中僅有3只圈養(yǎng)川金絲猴的樣本出現(xiàn)目的基因條帶(175 bp)(圖1)，說明部分圈養(yǎng)川金絲猴腸道內(nèi)的新鮮細(xì)胞數(shù)量較多。

為確認(rèn)野生川金絲猴是否因其他原因?qū)е翿NA提取失敗，隨機(jī)選取5只野生川金絲猴和顯示目的條帶的3只圈養(yǎng)川金絲猴進(jìn)行再驗(yàn)證，確認(rèn)了3只圈養(yǎng)川金絲猴樣品能提取出目的條帶，而野生個(gè)體沒有提取出目的條帶(圖1C)。

圖1 圈養(yǎng)和野生川金絲猴目的基因條帶

2.2 圈養(yǎng)和野生川金絲猴皮質(zhì)醇激素水平差異

試驗(yàn)結(jié)果表明，圈養(yǎng)川金絲猴糞便中的皮質(zhì)醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(12.68±5.18)pg/g，野生川金絲猴為(3.64±1.54)pg/g，兩組之間差異極顯著(P<0.01)，說明圈養(yǎng)川金絲猴糞便中的皮質(zhì)醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于野生川金絲猴。

2.3 圈養(yǎng)和野生雌性成年川金絲猴孕酮和皮質(zhì)醇水平差異

試驗(yàn)結(jié)果表明，圈養(yǎng)雌性川金絲猴皮質(zhì)醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(14.05±3.94)pg/g，野生雌性成年川金絲猴為(4.47±1.27)pg/g，二者組間差異極顯著(P<0.01)；圈養(yǎng)雌性川金絲猴孕酮含量為(52.77±22.28)pg/g，野生雌性成年川金絲猴為(6.03±2.42)pg/g，二者組間差異極顯著(P<0.01)，說明圈養(yǎng)雌性成年川金絲猴皮質(zhì)醇和孕酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于野生雌性成年川金絲猴。

2.4 圈養(yǎng)和野生成年雄性川金絲猴睪酮和皮質(zhì)醇水平差異

試驗(yàn)結(jié)果表明，圈養(yǎng)雄性成年川金絲猴皮質(zhì)醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(10.35±5.48)pg/g，野生雄性成年川金絲猴為(2.39±1.00)pg/g，二者組間差異顯著(P<0.05)；圈養(yǎng)雄性成年川金絲猴睪酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(6.00±3.40)pg/g，野生雄性成年川金絲猴為(2.88±1.11)pg/g，二者組間差異顯著(P<0.05)，說明圈養(yǎng)雄性成年川金絲猴睪酮水平顯著高于野生雄性成年川金絲猴。

3 討論

皮質(zhì)醇水平是評價(jià)動物應(yīng)激狀態(tài)的重要指標(biāo)之一，應(yīng)激能提高血清、唾液、糞便和毛發(fā)的皮質(zhì)醇水平[14]。糞便是獲取無損傷樣本最好的方式之一，糞便中的皮質(zhì)醇含量是評價(jià)動物應(yīng)激水平的可靠指標(biāo)之一，用糞便皮質(zhì)醇代謝物評價(jià)反芻動物的應(yīng)激水平是可靠的評價(jià)方法[15-16]。

本試驗(yàn)提取RNA的效率相對較低，究其原因可能是提取的樣本數(shù)量相對較少。提取出RNA的樣本均來自圈養(yǎng)川金絲猴，說明圈養(yǎng)川金絲猴腸道環(huán)境可能與野生川金絲猴不同，關(guān)于此方面的研究報(bào)道較少，還需進(jìn)一步研究。圈養(yǎng)川金絲猴的皮質(zhì)醇含量高于野生種，其原因可能是圈養(yǎng)川金絲猴在飼養(yǎng)和各種健康檢查過程中常受到來自人類及各種機(jī)器的驚嚇，導(dǎo)致其長期處于應(yīng)激狀態(tài)，而野生川金絲猴因多數(shù)時(shí)間處于警覺狀態(tài)，能夠更好地應(yīng)對外界突然刺激。因此，川金絲猴的保護(hù)應(yīng)以就地保護(hù)為主，圈養(yǎng)保護(hù)為輔，在進(jìn)行保護(hù)時(shí)，應(yīng)盡量減少人為接觸，多進(jìn)行安撫。

動物應(yīng)激水平與皮質(zhì)醇含量呈正相關(guān)，有研究表明妊娠期間皮質(zhì)醇和孕酮含量呈現(xiàn)相同的趨勢，但分娩后皮質(zhì)醇含量保持原有水平，但孕酮含量顯著下降[17]。本研究發(fā)現(xiàn)圈養(yǎng)川金絲猴的皮質(zhì)醇和孕酮含量顯著高于野生川金絲猴，這可能與雌性川金絲猴的發(fā)情狀態(tài)有關(guān)，有研究表明，皮質(zhì)醇升高，孕酮水平也升高[18]，皮質(zhì)醇和孕酮含量呈正相關(guān)[19]。也有可能是12月的樓觀臺溫度比佛坪高，導(dǎo)致動物發(fā)情時(shí)間提前，或是圈養(yǎng)動物皮質(zhì)醇高，引起了其他激素的變化。通過對裸鼴鼠(Heterocephalusglaber)的研究發(fā)現(xiàn)，睪酮和皮質(zhì)醇的水平呈正相關(guān)[20]，這與本研究結(jié)果相似。引起圈養(yǎng)雄性川金絲猴皮質(zhì)醇含量升高的原因可能與空間限制和圈養(yǎng)地點(diǎn)人密度較大有關(guān)[21-22]。

圈養(yǎng)川金絲猴糞便中的皮質(zhì)醇、睪酮和孕酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于野生川金絲猴，說明圈養(yǎng)條件會對川金絲猴的生殖激素造成影響，生殖激素的變化是否對川金絲猴的繁殖造成影響還需進(jìn)一步研究。