李甜榮,湯靜,祝競(jìng)芳,游萬(wàn)里,金鵬,鄭永華

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

火龍果(Hylocereusundatus)色彩奪目,外形奇特,果肉中富含黃酮類(lèi)物質(zhì)、維生素及水溶性膳食纖維,營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值極高[1]。鮮切果蔬是近年興起的新型消費(fèi)形式,發(fā)展迅速,應(yīng)用前景廣闊[2]?；瘕埞騻€(gè)大且要去皮,食用不便,特別適用于切分后食用,但切割造成的機(jī)械損傷會(huì)導(dǎo)致火龍果質(zhì)地軟化、汁液流失、組織褐變、微生物侵染等,嚴(yán)重影響其商品價(jià)值。Ca2+作為植物體內(nèi)的第二信使,參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程和逆境脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3],外源鈣處理也因其綠色、有效而被廣泛應(yīng)用于果蔬保鮮,對(duì)鮮切生姜[4]、生菜[5]、芒果[6]等的研究表明,外源鈣處理可延緩這些鮮切果蔬的后熟衰老,抑制組織褐變,減少抗壞血酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失,從而延長(zhǎng)貨架期。但氯化鈣處理對(duì)鮮切火龍果保鮮的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種廣泛存在于動(dòng)植物及微生物中的四碳非蛋白質(zhì)氨基酸,它具有促進(jìn)睡眠、減輕壓力、緩解焦慮、降血壓、調(diào)節(jié)心律失常和激素分泌等多種生理功效[7]。不同植物中GABA含量各不相同,一般為2～700 nmol·g-1[8]。研究表明,植物在受到低溫[9]、缺氧[10]和機(jī)械損傷[11]等逆境脅迫時(shí)會(huì)激發(fā)自身內(nèi)源酶的活性,進(jìn)而大量合成積累GABA,從而提高植物對(duì)這些逆境的抗性。鮮切處理造成的機(jī)械損傷雖然會(huì)給果蔬組織帶來(lái)軟化、褐變等一系列不良的生理生化反應(yīng),但同時(shí)也會(huì)誘導(dǎo)果蔬自身產(chǎn)生防御反應(yīng),生成多酚等次生代謝產(chǎn)物以修復(fù)損傷和抵抗微生物入侵[12]。近年來(lái)的研究表明,鮮切損傷還可誘導(dǎo)果蔬中GABA的富集,從而提高潛在的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值。例如鮮切處理通過(guò)激活GABA代謝關(guān)鍵酶的活性,促進(jìn)了胡蘿卜絲中GABA的積累[13-14]。另外,外源鈣處理可以提高鮮切胡蘿卜[15]和梨[16]中的GABA含量。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),鮮切處理可以誘導(dǎo)火龍果中酚類(lèi)物質(zhì)合成積累,提高其抗氧化性,且損傷強(qiáng)度越大,貯藏溫度越高,合成積累越多,抗氧化活性越高[17-18]。但有關(guān)鮮切加工和外源鈣處理對(duì)火龍果GABA的合成影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本試驗(yàn)先研究不同質(zhì)量濃度外源CaCl2處理對(duì)鮮切火龍果貯藏期間的品質(zhì)和GABA含量變化的影響,在此基礎(chǔ)上從GABA支路及多胺降解途徑探究鈣調(diào)控GABA富集的可能機(jī)制,以期為鮮切火龍果的加工保鮮和科學(xué)食用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

以‘白玉龍’火龍果為試材,挑選大小均勻、成熟度一致[可溶性固形物(TSS)含量13.3%左右]、無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)用于試驗(yàn)。

儀器:GL-20G-H型冷凍離心機(jī)購(gòu)于上海安亭科學(xué)儀器廠;UV-1600型紫外分光光度計(jì)購(gòu)于上海美譜達(dá)儀器有限公司;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋購(gòu)于上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;LC-20A高效液相色譜儀購(gòu)于日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1)不同質(zhì)量濃度CaCl2處理:將挑選好的果實(shí)用200 μmol·L-1次氯酸鈉溶液消毒2 min后,晾干表面水分,去皮后切割成1/4片狀(1 cm厚,損傷強(qiáng)度為3.2 cm2·g-1),分別置于0(蒸餾水)、5、10、15和20 g·L-1CaCl2溶液浸泡處理10 min。處理后的火龍果片用20 cm×12 cm×8 cm塑料保鮮盒包裝,每盒18片、約200 g,置于(10±1)℃、85%～90%相對(duì)濕度(RH)下貯藏,分別貯藏于12、24、48和72 h時(shí)取樣測(cè)定。取樣時(shí)每次隨機(jī)選取3盒,一部分用于測(cè)定果肉顏色、可溶性固形物、菌落總數(shù)等指標(biāo),另一部分液氮速凍后冷凍保存,用于測(cè)定其他指標(biāo)。其中10 g·L-1CaCl2處理能有效抑制鮮切火龍果微生物的生長(zhǎng)并顯著誘導(dǎo)GABA的合成。

2)10 g·L-1CaCl2及鈣調(diào)蛋白拮抗劑三氟拉嗪(TFP)處理:將鮮切后的火龍果片分別用蒸餾水、10 g·L-1CaCl2和200 μmol·L-1TFP[19]溶液浸泡處理10 min,處理結(jié)束后分裝于保鮮盒中,于(10±1)℃、85%～90% RH條件貯藏72 h,定期取樣進(jìn)行分析測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 果肉褐變指數(shù)(BI)測(cè)定采用Minolta CR200色差計(jì)隨機(jī)選取若干點(diǎn)測(cè)定其L*、a*和b*值。褐變指數(shù)計(jì)算公式[20]如下:

1.3.2 可溶性固形物(TSS)、可滴定酸(TA)和抗壞血酸(AsA)含量的測(cè)定使用手持阿貝折射儀(ATAGO,日本)測(cè)量TSS含量,結(jié)果以百分?jǐn)?shù)(%)表示。可滴定酸和抗壞血酸含量測(cè)定參照曹建康等[21]的方法,結(jié)果分別以蘋(píng)果酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)和mg·100 g-1表示。

1.3.3 菌落總數(shù)測(cè)定菌落總數(shù)測(cè)定參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定:GB 4789.2—2016》,結(jié)果以lg(CFU·g-1)表示。

1.3.4 谷氨酸、GABA和鈣調(diào)蛋白(CaM)含量測(cè)定谷氨酸含量測(cè)定參照Al-Quraan等[22]的方法,結(jié)果以mg·g-1表示。GABA含量測(cè)定參照Wang等[15]的方法,結(jié)果以mg·100 g-1表示。CaM含量采用酶聯(lián)免疫試劑盒(南京丁貝生物科技有限公司)按操作要求測(cè)定。

1.3.5 谷氨酸脫羧酶(GAD)和GABA轉(zhuǎn)氨酶(GABA-T)活性測(cè)定GAD活性測(cè)定參照Li等[23]的方法,將基于蛋白含量反應(yīng)體系每小時(shí)生成1 μg GABA定義為一個(gè)酶活單位。GABA-T活性采用酶聯(lián)免疫試劑盒(南京梅林學(xué)海生物科技有限公司)按操作要求測(cè)定。

1.3.6 多胺含量測(cè)定多胺含量測(cè)定參照林紹艷等[24]的方法,采用外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果以μg·g-1表示。

1.3.7 二胺氧化酶(DAO)、多胺氧化酶(PAO)和4-氨基丁醛脫氫酶(AMADH)活性測(cè)定DAO、PAO活性測(cè)定參照Wang等[15]的方法,將555 nm波長(zhǎng)下吸光值每變化0.001定義為一個(gè)酶活單位。AMADH活性測(cè)定參照Yin等[25]的方法,將340 nm波長(zhǎng)下吸光值每變化0.001定義為一個(gè)酶活單位。

上述測(cè)定酶的活性均基于蛋白含量反應(yīng)體系以U·mg-1表示,蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,用Origin 2018進(jìn)行繪圖。采用鄧肯氏多重比較法在0.05水平下進(jìn)行差異顯著性分析檢驗(yàn),即P<0.05表示差異顯著。

圖1 CaCl2處理對(duì)鮮切火龍果貯藏期間褐變指數(shù)(A)及可溶性固形物(TSS,B)、可滴定酸(C)和抗壞血酸(D)含量的影響Fig.1 Effect of CaCl2 treatment on browning index(A),and total soluble solids(TSS,B),titratable acid(C) and ascorbic acid(D)contents of fresh-cut pitaya fruit during storage

2 結(jié)果與分析

2.1 CaCl2處理對(duì)鮮切火龍果品質(zhì)的影響

由圖1-A可知:隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng),鮮切火龍果褐變指數(shù)(BI)不斷上升,CaCl2處理可延緩BI的上升,減輕果實(shí)的褐變程度,使其維持較好的感官品質(zhì),其中10 g·L-1CaCl2處理組效果最為顯著。如圖1-B所示:貯藏期間,鮮切火龍果的TSS含量整體呈下降趨勢(shì),且隨著鈣處理濃度增加TSS含量下降減少,但15和20 g·L-1CaCl2處理組之間差異不明顯。表明鈣處理在一定程度上可以抑制鮮切火龍果的呼吸作用,減少糖分損失,較好地保持鮮切火龍果的滋味品質(zhì)。由圖1-C所示:鮮切火龍果貯藏期間可滴定酸(TA)含量不斷下降,對(duì)照組在貯藏前期急劇下降,中后期變化平緩,至貯藏結(jié)束其TA含量與初始相比下降了29%,而CaCl2處理顯著延緩了TA含量的下降,維持火龍果較好的品質(zhì)。由圖1-D可知:AsA含量在貯藏期間整體呈下降趨勢(shì),前12 h下降幅度較大。CaCl2處理延緩了鮮切火龍果AsA含量的下降,且隨著鈣處理濃度增加下降減少。至貯藏結(jié)束時(shí),對(duì)照組火龍果中AsA含量與初始相比下降45.77%,而 20 g·L-1CaCl2處理組只下降19.59%,表明CaCl2處理可以減少鮮切火龍果AsA氧化的損失,從而使其保持較好的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。

2.2 CaCl2處理對(duì)鮮切火龍果菌落總數(shù)和GABA含量的影響

如圖2-A所示:貯藏期間鮮切火龍果菌落總數(shù)逐漸增加,但均未超過(guò)105CFU·g-1,不同質(zhì)量濃度CaCl2處理均可抑制微生物的生長(zhǎng)和菌落總數(shù)的增加,其中以10 g·L-1CaCl2處理組的效果最為顯著。如圖2-B所示:貯藏前期鮮切火龍果GABA含量迅速上升,于24 h達(dá)到峰值后開(kāi)始下降。CaCl2處理均促進(jìn)鮮切火龍果中GABA的合成積累,其中10 g·L-1CaCl2處理效果最顯著,在貯藏24 h時(shí)GABA含量比初始值增加54.6%。

上述結(jié)果表明,10 g·L-1CaCl2處理顯著抑制鮮切火龍果微生物的生長(zhǎng),延緩其品質(zhì)下降,提高鮮切火龍果中GABA的含量,從而改善其營(yíng)養(yǎng)和安全品質(zhì)。

圖2 CaCl2處理對(duì)鮮切火龍果貯藏期間菌落總數(shù)(A)和GABA含量(B)的影響Fig.2 Effect of CaCl2 treatment on total plate count(A)and GABA content(B)of fresh-cut pitaya fruit during storage

2.3 鈣和TFP處理對(duì)鮮切火龍果貯藏期間谷氨酸和GABA含量的影響

由圖3可知:鮮切火龍果谷氨酸含量在貯藏前期顯著下降,在24 h降到最小值后趨于平緩甚至緩慢上升;GABA含量在前24 h呈上升趨勢(shì),達(dá)到最大值后開(kāi)始下降。10 g·L-1CaCl2處理顯著促進(jìn)鮮切火龍果中GABA的合成積累,最高可達(dá)30.33 mg·100 g-1,且其谷氨酸含量低于對(duì)照組,表明可能有更多谷氨酸轉(zhuǎn)化生成GABA,而TFP處理則抑制了這一反應(yīng),生成較少的GABA。

圖3 鈣和三氟拉嗪(TFP)處理對(duì)鮮切火龍果貯藏期間谷氨酸(A)和GABA含量(B)的影響Fig.3 Effects of calcium and trifluoperazine(TFP)treatments on glutamate(A)and GABA contents(B) of fresh-cut pitaya fruit during storage 不同字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters indicate significant difference at 0.05 level among different treatments. The same as follows.

2.4 鈣和TFP處理對(duì)鮮切火龍果貯藏期間CaM含量和GAD、GABA-T活性的影響

由圖4-A可知:CaCl2處理提高了火龍果中CaM含量,于24 h達(dá)到峰值后開(kāi)始下降,可能促進(jìn)更多的Ca2+-CaM復(fù)合體形成,而TFP處理顯著降低了CaM含量,阻礙Ca2+-CaM復(fù)合體的形成。貯藏期間,各處理組GAD和GABA-T的活性均呈先上升后下降的趨勢(shì),CaCl2處理提高了GAD和GABA-T的活性,而TFP處理顯著降低了GAD活性,同時(shí)對(duì)GABA-T活性也有抑制(圖4-B、C)。表明10 g·L-1CaCl2處理可以激活鮮切火龍果中GABA代謝,提高CaM含量并誘導(dǎo)提升GAD活性,使更多的谷氨酸轉(zhuǎn)化成為GABA,進(jìn)而提高GABA含量,而TFP處理則降低了CaM含量并抑制GAD活性。

圖4 鈣和TFP處理對(duì)鮮切火龍果貯藏期間CaM含量(A)和谷氨酸脫羧酶(GAD,B)、GABA轉(zhuǎn)氨酶 (GABA-T,C)活性的影響Fig.4 Effects of calcium and TFP treatments on CaM content(A)and glutamate decarboxylase(GAD,B), γ-aminobutyric acid transaminase(GABA-T,C)activities of fresh-cut pitaya fruit during storage

圖5 鈣和TFP處理對(duì)鮮切火龍果貯藏期間腐胺、精胺、亞精胺含量及二胺氧化酶(DAO)、 多胺氧化酶(PAO)、4-氨基丁醛脫氫酶(AMADH)活性的影響Fig.5 Effects of calcium and TFP treatments on the contents of Put,Spm,Spd and activities of diamine oxidase(DAO),polyamine oxidase(PAO),4-aminobutyraldehyde dehydrogenase(AMADH) of fresh-cut pitaya fruit during storage

2.5 鈣和TFP處理對(duì)鮮切火龍果貯藏期間多胺降解途徑的影響

如圖5所示:貯藏前期對(duì)照組和CaCl2處理組火龍果的腐胺、精胺、亞精胺含量下降,中后期緩慢上升,且CaCl2處理組含量低于對(duì)照組;TFP處理組腐胺和精胺含量在前期先上升后下降,且含量顯著高于另外2個(gè)處理組,亞精胺含量呈先下降再上升后下降的趨勢(shì)。各處理組中DAO、PAO、AMADH活性變化趨勢(shì)一致,均先上升后下降,CaCl2處理提高了貯藏期間鮮切火龍果中DAO、PAO、AMADH活性,而TFP雖然是CaM抑制劑,但其也降低了DAO、PAO、AMADH活性,減少多胺降解轉(zhuǎn)化。表明10 g·L-1CaCl2處理可以激活多胺降解途徑,提高胺氧化酶活性,促使多胺底物降解轉(zhuǎn)化生成GABA,進(jìn)而提高GABA含量。

3 討論

火龍果經(jīng)過(guò)鮮切處理后細(xì)胞破碎,與空氣接觸的比表面積增加,易引起果肉褐變、組織軟化、汁液外流,并促進(jìn)微生物生長(zhǎng)繁殖,大大縮短貨架期,因此抑制果肉褐變、組織軟化及微生物生長(zhǎng)是鮮切火龍果保鮮的關(guān)鍵。Ca2+可作為植物細(xì)胞膜的保護(hù)劑,通過(guò)與磷脂、蛋白質(zhì)羥基和磷酸鹽橋接進(jìn)而增強(qiáng)膜穩(wěn)定性,且其可與細(xì)胞壁多糖交聯(lián)構(gòu)成離子鍵,維持細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)[26]。采用CaCl2處理可延緩鮮切果蔬組織褐變、減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失,從而延長(zhǎng)貨架期,如CaCl2處理可延遲鮮切馬鈴薯[27]、蘋(píng)果[28]中PPO活性高峰的到來(lái),延緩褐變進(jìn)程;抑制鮮切蘿卜[29]、芹菜[30]中TA、AsA含量的下降,減少還原糖和總糖消耗,從而延緩鮮切果蔬的衰老。本試驗(yàn)中,不同質(zhì)量濃度的CaCl2處理可以延緩鮮切火龍果中TSS、TA和AsA含量的下降,抑制微生物生長(zhǎng),減輕果肉褐變,降低有機(jī)物的消耗,并促進(jìn)GABA的合成,維持較好的貯藏品質(zhì)的同時(shí)提高其營(yíng)養(yǎng)特性。因此CaCl2處理在鮮切火龍果保鮮中具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

Ca2+作為高等植物中普遍存在的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,逆境脅迫下與CaM結(jié)合形成Ca2+-CaM復(fù)合體調(diào)控下游靶蛋白的活性,進(jìn)而介導(dǎo)調(diào)控由Ca2+引起的一系列脅迫反應(yīng),提高植物抗逆性[31-32],GABA合成積累也是植物抗逆反應(yīng)的表現(xiàn)。高等植物中GABA有2條合成轉(zhuǎn)化途徑,即GABA支路和多胺降解途徑,前者是主要合成途徑,谷氨酸在GAD作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)生成GABA,而后經(jīng)過(guò)GABA-T催化生成琥珀酸半醛,最終經(jīng)琥珀酸半醛脫氫酶催化生成琥珀酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)[7]。GAD作為GABA支路中的限速酶,是一種鈣調(diào)素結(jié)合蛋白,活性受Ca2+-CaM復(fù)合體的調(diào)控[33],TFP是CaM拮抗劑,可以影響Ca2+-CaM復(fù)合體的功能,阻礙植物間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]。植物中的多胺以游離狀態(tài)或與酚酸、核酸和蛋白質(zhì)結(jié)合存在[34],其可以在胺氧化酶和AMADH的催化作用下降解生成GABA。已有研究表明,外源CaCl2處理可以調(diào)控果蔬中GABA的合成,例如可以提高蘋(píng)果[35]和梨[36]果實(shí)中GAD的相對(duì)表達(dá)水平及酶活性,從而顯著促進(jìn)GABA的合成,有效激活GABA支路代謝。另有研究發(fā)現(xiàn)CaCl2處理可同時(shí)激活胡蘿卜絲[15]和鮮切梨[16]中的GABA支路及多胺降解途徑,顯著上調(diào)GAD、DAO、PAO和AMADH等酶基因相對(duì)表達(dá)水平并提高其活性,促進(jìn)谷氨酸和多胺的降解轉(zhuǎn)化,GABA含量明顯增加。在本試驗(yàn)中,貯藏前期谷氨酸含量急劇下降,表明可能有更多的谷氨酸參與反應(yīng)轉(zhuǎn)化生成GABA,后期變化平緩甚至上升可能是因?yàn)樯傻腉ABA被降解進(jìn)入TCA循環(huán)后轉(zhuǎn)化生成α-酮戊二酸,進(jìn)而促進(jìn)谷氨酸的合成。Wu等[37]研究認(rèn)為茶葉中腐胺是多胺降解途徑中GABA合成的主要底物。本試驗(yàn)中貯藏前期對(duì)照組和CaCl2處理組腐胺含量急劇下降,表明其可能更多參與降解途徑,分解大于合成,從而生成更多的GABA。此外,10 g·L-1CaCl2處理提高了鮮切火龍果貯藏期間CaM含量和GAD、DAO、PAO、AMADH活性,催化更多谷氨酸和多胺轉(zhuǎn)化,進(jìn)而提高GABA含量,這與貯藏前期火龍果中谷氨酸、多胺含量的降低相互印證,而TFP處理CaM含量較低,GAD和胺氧化酶的活性也被抑制,底物轉(zhuǎn)化減少,合成較少的GABA。這些結(jié)果表明,10 g·L-1CaCl2處理可同時(shí)激活鮮切火龍果中的GABA支路和多胺降解途徑,其可能通過(guò)促進(jìn)Ca2+-CaM復(fù)合體的形成進(jìn)而提高GAD和胺氧化酶的活性從而促進(jìn)GABA的合成積累,而TFP處理則可能阻礙了Ca2+-CaM復(fù)合體的形成,使其功能發(fā)生障礙,降低了GAD和胺氧化酶的活性,從而減少GABA的生物合成。因此外源鈣處理可能通過(guò)調(diào)控鮮切火龍果中Ca2+-CaM復(fù)合體的形成進(jìn)而促進(jìn)GABA的合成積累,但關(guān)于外源鈣處理促進(jìn)GABA積累的分子機(jī)制尚不清楚,有待于進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)研究表明,10 g·L-1CaCl2處理可有效減少10 ℃貯藏條件下鮮切火龍果TSS、TA消耗、AsA氧化,減輕果肉褐變,抑制微生物生長(zhǎng),維持較好的品質(zhì),從而延長(zhǎng)貨架期。此外,10 g·L-1CaCl2處理還顯著促進(jìn)鮮切火龍果中GABA的合成,提高CaM含量及GAD和胺氧化酶的活性,催化谷氨酸和多胺降解轉(zhuǎn)化,促進(jìn)GABA的合成積累,而TFP處理降低了CaM含量,抑制了GAD及胺氧化酶的活性和GABA的積累,表明鈣處理可能是通過(guò)調(diào)控Ca2+-CaM復(fù)合體的形成進(jìn)而促進(jìn)GABA的合成積累。