劉洋,周振雷

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

脂質(zhì)是人和動(dòng)物的重要營(yíng)養(yǎng)素之一,為機(jī)體提供能量和必需脂肪酸。與哺乳動(dòng)物脂肪組織作為脂質(zhì)代謝的主要部位不同,肝臟是禽類(lèi)脂肪代謝的主要器官,而脂肪組織主要用于脂肪酸的儲(chǔ)存[1-2]。肝臟通過(guò)分解膽固醇產(chǎn)生膽汁酸,有助于脂質(zhì)消化吸收[3]。對(duì)蛋雞來(lái)說(shuō),雞蛋內(nèi)的脂類(lèi)物質(zhì)主要由機(jī)體自身內(nèi)源性合成,產(chǎn)蛋時(shí)脂質(zhì)代謝途徑頻繁周轉(zhuǎn),肝臟脂肪生成提高[4-5]。隨著日齡的增長(zhǎng),經(jīng)密集產(chǎn)蛋后肝臟脂質(zhì)代謝紊亂,易導(dǎo)致脂肪在肝臟中過(guò)度沉積,從而影響家禽的健康和生產(chǎn)性能[6-7]。例如籠養(yǎng)蛋雞肝臟脂質(zhì)的沉積是脂肪肝出血綜合征的誘因,導(dǎo)致產(chǎn)蛋率急劇下降,蛋雞死亡率升高[8]。此外,腹部脂肪的沉積與飼料效率呈負(fù)相關(guān)[9]。因此,調(diào)節(jié)蛋雞脂質(zhì)代謝有利于提高蛋雞養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益和改善動(dòng)物福利。

丁酸是后腸微生物發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生的一種四碳短鏈脂肪酸,通過(guò)影響腸道及鄰近組織發(fā)揮作用。作為一種安全的飼料添加劑,丁酸具有調(diào)節(jié)動(dòng)物能量代謝,改善腸道健康,提高免疫力,改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能和健康的功能,已經(jīng)在畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用了幾十年。在蛋雞日糧中添加丁酸或其鹽還可提高蛋雞的產(chǎn)蛋率和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用,改善蛋品質(zhì)[10-12]。與此同時(shí),丁酸在脂質(zhì)代謝的調(diào)控中有較好的應(yīng)用前景。有研究表明,日糧中添加丁酸鈉能提高肉仔雞屠宰率,降低腹部脂肪含量[13]。此外,已有研究表明,禁食后復(fù)喂丁酸鈉可降低脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá),降低肝臟甘油三酯的含量[14]。然而,關(guān)于丁酸對(duì)蛋雞脂質(zhì)代謝的調(diào)控尚缺乏系統(tǒng)的研究與報(bào)道。丁酸鈣是丁酸的鈣鹽,有報(bào)道稱(chēng)丁酸鈣可以提高肉仔雞脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的消化率[15],但目前尚無(wú)丁酸鈣對(duì)蛋雞脂質(zhì)代謝影響的研究報(bào)道。因此,本研究旨在研究基礎(chǔ)日糧中添加丁酸鈣對(duì)蛋雞脂質(zhì)沉積的影響并探討其機(jī)制,為其生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

丁酸鈣(純度90%)購(gòu)于廣州英賽特生物技術(shù)有限公司;4%多聚甲醛、無(wú)水乙醇、二甲苯、蘇木精伊紅(HE)染色液購(gòu)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)材料供應(yīng)中心;TRIzol試劑購(gòu)于南京奧青生物技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)選取480只42周齡的海蘭褐蛋雞,隨機(jī)分為4組,分別在基礎(chǔ)日糧(表1)中添加0、500、1 000和1 500 mg·kg-1的丁酸鈣。預(yù)飼期1周,試驗(yàn)期為8周。每組8個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)15只蛋雞(每籠5只)。每日光照16 h。所有蛋雞自由采食和飲水。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 1 Ingredient composition and nutrient contents of basal diet

1.3 樣品采集

在第8周末,每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取體重相近的一只雞稱(chēng)重,翅靜脈采血后通過(guò)頸椎脫位處死。分離肝臟和腹部脂肪并稱(chēng)重,以計(jì)算與體重的比值,分別稱(chēng)為肝臟指數(shù)和腹脂率。采集同一部位的肝臟,生理鹽水沖洗后,一部分組織置于4%的多聚甲醛中,另一部分組織用液氮速凍后-80 ℃保存。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.4.1 血清生化指標(biāo)檢測(cè)血清中甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)采用自動(dòng)生化分析儀(BX-4000,Sysmex)檢測(cè)。

1.4.2 組織內(nèi)TC、TG含量的測(cè)定準(zhǔn)確稱(chēng)量肝臟和蛋黃組織30 mg,加入270 μL無(wú)水乙醇進(jìn)行勻漿,2 500 r·min-1離心10 min,取上清液用比色法測(cè)定蛋黃TC和肝臟TC、TG的含量。

1.4.3 肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)將固定的組織進(jìn)行石蠟包埋,將包埋蠟塊切成5 μm厚切片,蘇木精伊紅(HE)染色后,倒置顯微鏡(CKX53,Olympus,日本)下觀察并拍照。

1.4.4 肝臟RNA提取和Real-time PCR使用Trizol試劑按照說(shuō)明書(shū)提取肝臟總RNA。用NanoDrop 2000分光光度計(jì)在D260/D280處測(cè)定RNA濃度,并將所有樣品稀釋至500 ng·μL-1,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。使用SYBR qPCR Master Mix試劑盒在ABI PRISM 7300 HT序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。目的基因的引物序列如表2所示。以GAPDH作為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCT計(jì)算基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表2 熒光定量PCR的引物序列Table 2 Sequence used for real-time PCR

1.5 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),各組間差異用Tukey法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸鈣對(duì)蛋雞肝臟指數(shù)和腹脂率的影響

從圖1可見(jiàn):與對(duì)照組相比,基礎(chǔ)日糧中分別添加500和1 000 mg·kg-1丁酸鈣的蛋雞肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05),1 000和1 500 mg·kg-1丁酸鈣處理的蛋雞腹脂率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

圖1 丁酸鈣對(duì)蛋雞肝臟指數(shù)和腹脂率的影響Fig.1 Effects of calcium butyrate on liver index and abdominal fat percentage of laying hens各組間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters indicate significant differences among groups(P<0.05). The same below.

2.2 丁酸鈣對(duì)蛋雞血清脂質(zhì)含量的影響

如表3所示:添加1 500 mg·kg-1丁酸鈣有降低TC、TG、HDL-C、LDL-C含量的趨勢(shì),但與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

表3 丁酸鈣對(duì)蛋雞血清脂質(zhì)含量的影響Table 3 Effects of calcium butyrate on serum lipid content of laying hens

2.3 丁酸鈣對(duì)蛋雞肝臟和蛋黃脂質(zhì)含量的影響

如圖2所示:與對(duì)照組相比,添加500 mg·kg-1丁酸鈣顯著降低肝臟TG的含量(P<0.05)。添加500和1 000 mg·kg-1丁酸鈣的蛋雞蛋黃的TC含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05),而添加丁酸鈣對(duì)肝臟TC含量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

圖2 丁酸鈣對(duì)蛋雞肝臟和蛋黃甘油三酯(TG)和膽固醇(TC)含量的影響Fig.2 Effects of calcium butyrate on triglyceride(TG)and cholesterol(TC)contents in liver and yolk of laying hens

2.4 丁酸鈣對(duì)蛋雞肝臟組織形態(tài)的影響

如圖3所示:對(duì)照組肝細(xì)胞內(nèi)有大小不一的脂滴(箭頭所示),添加丁酸鈣后脂滴的沉積明顯減少。

圖3 丁酸鈣對(duì)蛋雞肝臟組織形態(tài)的影響Fig.3 Effects of calcium butyrate on liver histomorphology of laying hens

圖4 丁酸鈣對(duì)蛋雞脂質(zhì)合成(A)、分解與利用(B)相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of calcium butyrate on expression levels of genes related to lipid synthesis(A) and lipid decomposition and utilization(B)of laying hens

2.5 丁酸鈣對(duì)蛋雞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響

如圖4所示:與對(duì)照組相比,添加1 000和1 500 mg·kg-1丁酸鈣蛋雞的SREBP-1c和ACCmRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05),添加500 mg·kg-1丁酸鈣蛋雞的ACCmRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。與對(duì)照組相比,添加500和1 500 mg·kg-1丁酸鈣蛋雞的CPT1αmRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。添加不同濃度丁酸鈣蛋雞的CYP8B1mRNA表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討論

丁酸作為一種酸化劑可以降低胃腸道內(nèi)的酸堿度,提高產(chǎn)蛋后期蛋雞乳桿菌、雙歧桿菌等有益菌的數(shù)量,降低沙門(mén)氏菌、大腸桿菌等有害菌的數(shù)量,增加腸道絨毛高度與隱窩深度的比值,改善消化酶活性[10,16]。此外丁酸還能提高蛋雞的產(chǎn)蛋率、蛋質(zhì)量和飼料轉(zhuǎn)化率,促進(jìn)腸道營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá),降低飼料成本,提高生產(chǎn)利潤(rùn)[12,17]。目前有關(guān)丁酸對(duì)蛋雞脂質(zhì)代謝影響的研究較少。

蛋雞腹部脂肪的過(guò)度沉積影響蛋雞的生產(chǎn)性能[18]。本研究結(jié)果顯示,隨著日糧中丁酸鈣添加量的增加,腹脂率呈劑量依賴(lài)性下降,表明飼喂丁酸鈣可降低蛋雞脂肪沉積。這與之前肉仔雞的研究結(jié)果一致[19]。肝臟是家禽脂質(zhì)代謝(如脂質(zhì)合成、分解和轉(zhuǎn)運(yùn))的主要器官。日糧中添加0.1%丁酸鈉可以使21日齡肉雞的肝臟指數(shù)降低[20],本研究結(jié)果與之相似,添加500或1 000 mg·kg-1丁酸鈣蛋雞的肝臟指數(shù)均降低。產(chǎn)蛋可促進(jìn)肝臟合成脂肪,TG作為能量的供體[21],其在肝臟中的積累程度是脂質(zhì)代謝紊亂的指標(biāo)。先前有研究發(fā)現(xiàn)丁酸鈉可降低高脂日糧小鼠肝臟的TG水平[22],也有研究表明包被丁酸鈉可降低蛋雞血清中TG水平[10],本研究結(jié)果表明飼喂500 mg·kg-1丁酸鈣可降低肝臟TG含量,但血清脂質(zhì)含量沒(méi)有發(fā)生顯著變化。添加丁酸鈣還緩解了肝臟中的脂滴沉積。以上結(jié)果表明添加丁酸鈣可能通過(guò)降低蛋雞肝臟脂質(zhì)沉積,改善脂質(zhì)代謝紊亂的狀況。

雞蛋富含多種營(yíng)養(yǎng)素,但其高膽固醇含量導(dǎo)致的健康問(wèn)題已引起社會(huì)的廣泛關(guān)注[23]。最近有研究表明有機(jī)酸和絲蘭提取物能降低血清和蛋黃膽固醇水平[24],本研究結(jié)果與之相似,日糧中添加500或1 000 mg·kg-1丁酸鈣蛋黃的膽固醇含量均降低,這可能與膽固醇吸收與合成減少、糞便膽固醇排泄增加有關(guān)。

為了進(jìn)一步揭示丁酸鈣降脂作用的機(jī)制,本研究檢測(cè)了脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)。ACC是第1個(gè)脂肪酸合成過(guò)程中的限速酶,FAS位于胞質(zhì)中,能催化脂肪酸碳鏈伸長(zhǎng),在脂肪生成過(guò)程中起到重要作用[25-26]。SREBP-1c是調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的重要轉(zhuǎn)錄因子,可激活FAS和ACC調(diào)控脂肪酸生成[27-28]。PPARγ是脂肪細(xì)胞分化和生成的關(guān)鍵調(diào)控因子,調(diào)控成脂基因的表達(dá)[21]。在本研究中,日糧添加1 000或1 500 mg·kg-1丁酸鈣蛋雞肝臟的ACC和SREBP-1cmRNA表達(dá)量降低,可能導(dǎo)致脂肪酸合成能力的減弱。這與之前的研究類(lèi)似,其機(jī)制可能是丁酸鈣通過(guò)激活A(yù)MP依賴(lài)的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)調(diào)控這些基因的表達(dá)來(lái)抑制脂質(zhì)生成[14,29]。本研究中,各組肝臟FAS和PPARγmRNA表達(dá)無(wú)顯著差異,而有研究表明,日糧中添加丁酸鈉可提高仙居雞肝臟中PPARγ的表達(dá)[30],結(jié)果不一致的原因可能與添加丁酸的種類(lèi)和劑量不同有關(guān)。CPT1和ACOX是脂肪酸β氧化中的限速酶[31]。FXR是膽汁酸的受體,在調(diào)節(jié)腸肝循環(huán)和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要的作用[32]。本研究中,日糧中添加500或1 500 mg·kg-1丁酸鈣均上調(diào)了CPT1αmRNA的表達(dá),說(shuō)明蛋雞脂肪酸分解能力可能增強(qiáng),這與之前在斷奶仔豬上的研究結(jié)果相似[33]。在本研究中,各組間肝臟FXR和ACOXmRNA表達(dá)無(wú)顯著差異,提示丁酸鈣并非通過(guò)FXR-ACOX途徑調(diào)控脂質(zhì)分解。CYP7A1是膽汁酸合成過(guò)程中經(jīng)典途徑的第1個(gè)限速酶,主要生成膽酸和鵝去氧膽酸,而CYP8B1調(diào)控膽酸和鵝去氧膽酸的比值[34-35]。有趣的是,添加丁酸鈣組肝臟CYP8B1mRNA的表達(dá)量降低,提示膽固醇分解能力減弱,原因可能為腸道中的膽固醇吸收減少或排泄增加維持了膽固醇的動(dòng)態(tài)平衡[36]。

綜上,日糧中添加丁酸鈣減少肝臟、蛋黃和腹部脂肪沉積,這可能與丁酸鈣上調(diào)肝臟CPT1αmRNA的表達(dá),下調(diào)肝臟SREBP-1c、ACC和CYP8B1mRNA的表達(dá)有關(guān),其中1 000 mg·kg-1丁酸鈣添加效果最佳。