李林俐,朱來旭,張雪,費榮梅*
(1.南京農業(yè)大學農業(yè)農村部動物細菌學重點實驗室,江蘇 南京 210095;2.深圳海關,廣東 深圳518026)
揚子鱷(Alligatorsinensis)為我國一級重點保護野生動物,被《世界自然保護聯(lián)盟》(IUCN)的紅色名錄列為極度瀕危物種。自1987年我國開始揚子鱷的人工飼養(yǎng)繁育,現(xiàn)已經取得巨大成功。近年來,由于種群密度增大、遺傳進化等原因,揚子鱷疾病時有發(fā)生。對越冬期間人工養(yǎng)殖條件下的發(fā)病揚子鱷取樣檢測,均發(fā)現(xiàn)有尿酸鹽沉積、腎病等癥狀,從發(fā)病的揚子鱷體內分離到多株普通變形桿菌,且該變形桿菌與人工養(yǎng)殖揚子鱷的發(fā)病不無關聯(lián)[1]。
變形桿菌(Proteus)為革蘭陰性條件致病菌,屬于腸桿菌科變形桿菌屬,廣泛存在于動物腸道、土壤和養(yǎng)殖水體等環(huán)境中[2]。近年來,關于該菌屬細菌引起的人食物中毒及動物細菌性疾病的案例多有報道,如對蝦、中華鱉、石斑魚等[3-8]。變形桿菌的FliL、ZapA、HpmA、HpmB、RpoA等毒力因子均可在不同毒性揚子鱷源普通變形桿菌菌株中檢測到,但并未發(fā)現(xiàn)這些毒力因子與菌株毒力強弱的線性關系[9]。變形桿菌可分化為2種細胞形態(tài):在液體環(huán)境中的短桿狀的泳動細胞(swimmer cell)長度1.5~2.0 μm,每個細菌有4~10根鞭毛[10];在黏性環(huán)境中的群集細胞(swarmer cell)中,長度10~80 μm,其胞質內有多個均勻間隔的類核,每個小區(qū)由數(shù)百或數(shù)千鞭毛推動[11-13],這些細胞沿該細胞體長軸緊密排列形成1個群體,可在鞭毛的推動下,快速遷移運動[14]。群集細胞的細胞質內有多個均勻間隔的小區(qū),每個小區(qū)由數(shù)百或數(shù)千鞭毛推動,群集細胞可獨特地適應宿主細胞表面環(huán)境,是調節(jié)幾種重要致病因子的關鍵。在奇異變形桿菌中有超過50種基因參與群集細胞的分化[15]。細菌的周期性群集運動(swarming motility,SM)是指運動細菌以群體方式在培養(yǎng)基表面由接種點向周圍進行的依賴鞭毛的遷移運動。對變形桿菌的進一步研究表明,其分化能力和SM均與其致病性緊密相關[16]。FliL基因是鞭毛操縱子中的第一個基因,其編碼蛋白是一種單跨膜蛋白,由160個氨基酸組成的小蛋白質(相對分子質量:18 000),位于Mot蛋白附近,可與位于細胞質膜上方的MS(membrane/supramembrane)環(huán)相互作用,可在高負荷條件下(如高黏性環(huán)境中)對加強鞭毛馬達功能起重要作用[17-18]。
鑒于細菌鞭毛與細菌的致病性和趨利避害的化學趨向性運動緊密相關,為探究FliL基因對揚子鱷源普通變形桿菌生物學特性的影響,本試驗通過Red重組系統(tǒng)對揚子鱷源普通變形桿菌進行FliL基因敲除,構建FliL基因缺失株和互補株,通過比較野生株與FliL基因缺失株在細菌運動性和對小鼠致病性上的差異,來探究FliL基因在揚子鱷源普通變形桿菌中的作用,為研究人工養(yǎng)殖揚子鱷痛風癥的致病機制提供理論支持,也為人工養(yǎng)殖揚子鱷的疾病防控提供基礎依據。
揚子鱷源普通變形桿菌XX2株由筆者所在實驗室分離、純化和保存,于2012—2013年分離于安徽省宣城揚子鱷繁殖研究中心發(fā)病揚子鱷。根據GenBank已公布的變形桿菌HI4320(NC_010554.1)的FliL基因序列,使用Primer Premier 5.0設計特異性引物。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成(表1)。質粒pKD4、pKD46、pCP20、pGEN-MCS均由筆者所在實驗室保存。
表1 本試驗所用的引物序列Table 1 Primers sequences in this study
以pKD4質粒(2邊帶有FRT位點和Kanr基因)為模板,利用引物對C-FliL-F/R擴增打靶片段,目的片段為1 647 bp。50 μL PCR反應體系:2×FastTaqPCR Master Mix 25 μL,上、下游引物(10 mol·L-1)各 1 μL,菌液模板2 μL,ddH2O 21 μL。反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s,共29個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產物于10 g·L-1瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。
將XX2菌液按照1∶100(體積比)轉接LB培養(yǎng)基,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期,冰浴20 min,5 000 r·min-1離心10 min,收集菌體,先用ddH2O充分洗滌2次,再用10%滅菌甘油洗滌2次,最后用10%滅菌甘油以1∶100重懸細胞,制成XX2感受態(tài)細胞。
將pKD46質粒(帶有Ampr基因)電擊轉化XX2感受態(tài)細胞。電擊參數(shù):電壓2.25 kV,電阻200 Ω,電容 25 μF。電擊后加入30 ℃預熱的LB液體培養(yǎng)基,30 ℃、100 r?min-1振蕩培養(yǎng)約1 h后,取100 μL涂布于含50 μg·mL-1Amp的抗性LB平板,30 ℃培養(yǎng)2~3 h后篩選陽性克隆。
將篩選好的XX2/pKD46重組菌按照1∶100轉接到LB液體培養(yǎng)基,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期,按照1∶100加入L-阿拉伯糖誘導1 h,再按照1.4節(jié)方法制備電轉化感受態(tài)細胞,利用電轉化法導入打靶片段,進行重組替換,依次用含有Kan和Amp的平板篩選出對Amp敏感且有Kan抗性的重組菌XX2ΔFliL∶∶Kan。用FliL基因鑒定引物對R-FliL-F/R對FliL基因進行PCR驗證。50 μL PCR反應體系:2×FastTaqPCR Master Mix 25 μL,上、下游引物(10 mol·L-1)各1 μL,菌液模板2 μL,ddH2O 21 μL。反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s,共29個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產物于10 g·L-1瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。
用卡那抗性基因同源臂鑒定引物對E-FliL-F/R對重組菌株進行PCR鑒定。50 μL PCR反應體系:2×FastTaqPCR Master Mix 25 μL,上、下游引物(10 mol·L-1)各1 μL,菌液模板2 μL,ddH2O 21 μL。反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s,共29個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產物于10 g·L-1瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。
將pCP20質粒(溫敏性質粒)電擊轉化XX2ΔFliL∶∶Kan菌株以消除其Kanr基因,37 ℃培養(yǎng)過夜。先將菌液接種普通LB平板,再挑單菌落接種含有Kan的LB平板,挑選出不能在含Kan的LB平板上生長的單菌落。最后于42 ℃培養(yǎng)消除pCP20質粒,獲得普通變形桿菌XX2FliL基因缺失株XX2ΔFliL。
以XX2菌株的基因組DNA為模板,用引物對MCS-F/R擴增FliL基因。50 μL PCR反應體系:2×FastTaqPCR Master Mix 25 μL,上、下游引物(10 mol·L-1)各1 μL,菌液模板2 μL,ddH2O 21 μL。反應條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 90 s,共29個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產物于10 g·L-1瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。
將該片段克隆至轉移載體pGEN-MCS(轉移質粒),獲得互補質粒pGEN-MCS-FliL。質粒經上海生工生物工程技術有限公司測序驗證后,再按照1.4節(jié)方法制備電轉化XX2ΔFliL感受態(tài)細胞,將互補質粒轉化XX2ΔFliL感受態(tài)細胞,用含有Amp的LB平板進行篩選,PCR驗證后獲得互補株XX2ΔFliL/pFliL。
你們看不起我。我說著,從褲兜里掏出一把小刀,刺啦一下劃破自己的手臂,血像一條紅色的蚯蚓,翻滾著掉在地上。我今天以血為誓,咱走著瞧,非混出個樣子來給你們看看,這瞎巴大學,我不讀,照樣出人頭地。我罵完這一句,咣當一聲甩開門,出了宿舍。
將培養(yǎng)過夜的XX2株、XX2ΔFliL株和XX2ΔFliL/pFliL株分別以1∶100的體積比接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng),每隔30 min取樣1次,共取樣24次,測定不同時期菌液D600值,使用軟件Graphpad Prism 8.0繪制生長曲線。
挑取XX2株和XX2ΔFliL株單菌落于1 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)過夜。在Mot半固體瓊脂(3 g·L-1瓊脂)培養(yǎng)基和LB固體瓊脂培養(yǎng)基中心點接種過夜培養(yǎng)物。通過分時段測量細菌在LB固體瓊脂培養(yǎng)基表面的遷移距離和遷移速度來測定細菌的群集運動。通過分時段測量細菌在Mot半固體瓊脂培養(yǎng)基表面的遷移距離和遷移速度來判斷細菌動力,再將過夜培養(yǎng)的菌液以1∶100稀釋后接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)2.75 h(此時菌株可產生最多的假性群集細胞[15]),將培養(yǎng)物涂布于LB固體瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)4.5 h。顯微鏡觀察前用2 mL PBS沖洗LB瓊脂表面。
分別將XX2株和XX2ΔFliL株的LB培養(yǎng)物以1∶100接種THB液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)8 h。用生理鹽水稀釋菌液并配制成1×104、1×105、1×106、1×107和1×108CFU·mL-1的菌液。取清潔級雄性小鼠40只,隨機分為2大組,每大組又隨機分為5小組,每小組4只小鼠。每組分別腹腔注射不同濃度稀釋菌液0.2 mL。飼養(yǎng)、觀察并記錄小鼠的死亡情況。
以pKD4為模板擴增FliL基因上、下游同源臂及Kan抗性基因所得的同源重組片段,PCR產物大小與目標片段1 647 bp大小相符(圖1-A)。將同源重組片段電轉化至XX2感受態(tài)細胞后,FliL基因與同源片段進行重組,再利用重組菌株帶有Kan抗性的特點對獲得菌株進行初步篩選,得到疑似FliL基因缺失的菌株。因為FliL編碼基因全序列短于同源臂DNA片段長度,用引物對C-FliL-F/R進一步進行PCR鑒定,篩選出FliL基因缺失株(如圖1-B所示),缺失陰性株能夠檢測到目標FliL基因770 bp大小的條帶。再用E-FliL-F/R與R-FliL-F/R引物對進行PCR鑒定,結果如圖1-C所示。
圖1 FliL基因缺失株的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of FliL gene fragment deletion strain A. 引物對C-FliL-F/R擴增同源重組片段(M. DNA標準品;1、2. 同源重組片段);B. 引物對R-FliL-F/R對重組菌株的鑒定(M. DNA標準品;1. FliL基因缺失株;2. 缺失對照);C. 引物對E-FliL-F/R對重組菌株的鑒定(M. DNA標準品;1~10. Kan抗性陽性株;11. Kan抗性陰性株;12. 空白對照)。A. The peimer pairs C-FliL-F/R amplified homologous recombination fragment(M. DNA Marker;1,2. Homologous recombination fragment).B. The peimer pairs C-FliL-F/R identified the recombinant strains(M. DNA Marker;1. XX2ΔFliL strain;2. Deletion control). C. The peimer pairs E-FliL-F/R identified the recombinant strains(M. DNA Marker;1-10. Kanr positive strain;11. Kanr negative strain;12. Blank control).
互補質粒pGEN-MCS-FliL電轉化至XX2ΔFliL感受態(tài)后,經含有Amp的LB平板篩選挑取疑似菌落進行PCR驗證,PCR產物經10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳。結果(圖2)顯示,有與預期大小相符的2 784 bp特異性條帶,表明互補質粒pGEN-MCS-FliL成功轉入XX2ΔFliL菌株,獲得互補株XX2ΔFliL/pFliL。
圖2 互補株XX2ΔFliL/pFliL的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of complementary strains of XX2ΔFliL/pFliL M. DL5000 DNA標準品;1:互補株陰性;2. 互補株陽性。M. DL5000 DNA marker;1. Complementary strain of negative;2. Complementary strain of postivite.
如圖3所示:XX2株、XX2ΔFliL株和XX2ΔFliL/pFliL株的生長速度在接種后的前5 h沒有明顯區(qū)別(X2=4.134×10-3,P>0.05),5 h后野生株XX2的生長速度均快于FliL基因缺失株XX2ΔFliL和互補株XX2ΔFliL/pFliL,而互補株XX2ΔFliL/pFliL的生長速度快于FliL基因缺失株XX2ΔFliL。
圖3 XX2株、XX2ΔFliL株和XX2ΔFliL/pFliL株的生長曲線Fig.3 The growth curve of XX2、XX2ΔFliL and XX2ΔFliL/pFliL strains
圖4 細菌在LB固體瓊脂培養(yǎng)基(A)和Mot半固體瓊脂培養(yǎng)基(B)上的運動情況Fig.4 The movement of bacteria on LB solid agar medium(A)and Mot semi-solid agar medium(B)
XX2株和XX2ΔFliL株過夜培養(yǎng)物接種Mot半固體瓊脂培養(yǎng)基和LB固體瓊脂培養(yǎng)基,觀察細菌群集細胞的遷移運動,如圖4所示。分時段測量并記錄XX2株和XX2ΔFliL株在LB固體瓊脂培養(yǎng)基和Mot半固體瓊脂培養(yǎng)基上遷移距離與遷移速度。如圖5所示,在LB固體瓊脂培養(yǎng)基表面XX2ΔFliL株的遷移距離遠低于XX2株,遷移速度低于XX2株。在Mot半固體瓊脂培養(yǎng)基上XX2ΔFliL株的遷移距離略低于XX2株,其遷移速度也沒有顯著差異(X2=3.649,P>0.05)。
將稀釋后的過夜培養(yǎng)物接種新鮮LB液體培養(yǎng)基,取37 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)2.75 h后的假性群集細胞培養(yǎng)物涂布LB固體瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)4.5 h后在光學顯微鏡下觀察。如圖6所示:視野可見野生株在培養(yǎng)基表面細胞體長軸上緊密排列形成一個群體,而FliL基因缺失株則為單細胞狀態(tài)。
圖5 細菌在LB固體培養(yǎng)基(A、C)和Mot半固體培養(yǎng)基(B、D)上的遷移情況Fig.5 The migration of bacteria on LB solid medium(A,C)and Mot semi-solid medium(B,D)
小鼠致病性試驗結果顯示,XX2株對小鼠的LD50為2.3×106CFU·mL-1,致病力強XX2ΔFliL株對小鼠的LD50為4.9×108CFU·mL-1,FliL基因缺失株LD50升高了約100倍,致病力弱。表明FliL基因的缺失會導致?lián)P子鱷源普通變形桿菌毒力的下降。
圖6 細菌在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)4.5 h后的形態(tài)Fig.6 The morphology of bacteria after culturing in LB medium for 4.5 h
表2 XX2株和XX2ΔFliL株對小鼠的半數(shù)致死量(LD50)
變形桿菌為革蘭陰性菌,具鞭毛、無莢膜、無芽胞,在固體培養(yǎng)基上呈擴散生長,可形成遷移生長現(xiàn)象[19]。鞭毛作為細菌運動最常見的細胞器之一,是由細胞表面突出的絲狀螺旋槳結構和嵌入細胞膜的旋轉馬達組成。FliL基因是變形桿菌中的1個重要毒力因子,同時也是鞭毛操縱子中的第1個基因,其編碼的單跨膜蛋白可與位于細胞質膜上的MS環(huán)相互作用,在高負荷條件下(如高黏性環(huán)境中)起到加強鞭毛馬達功能的作用[17-18]。
本試驗利用Red重組系統(tǒng)對揚子鱷源普通變形桿菌的FliL基因進行敲除,成功構建FliL基因缺失株和互補株。細菌生長曲線結果顯示:接種5 h后FliL基因缺失株生長速度慢于野生株,說明FliL基因的缺失確實會影響揚子鱷源普通變形桿菌的增殖,但其機制仍有待進一步研究。有研究表明,FliL基因缺陷會導致特異性表型的變化,如在螺旋體中,曾觀察到FliL基因突變體在運動性上具有缺陷,并伴隨周質鞭毛方向的逆轉[20]。在α-桿菌屬物種中,FliL基因無效突變可導致非運動表型[21]或鞭毛的釋放[22]。在腸道細菌如大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌和奇異變形桿菌中,FliL基因的缺失并不影響其泳動運動,但在群集運動中具有明顯的缺陷[23],在本試驗中該現(xiàn)象同樣得到證實。本試驗細菌群集運動和動力試驗結果顯示:在LB固體瓊脂培養(yǎng)基表面FliL基因缺失株的遷移距離遠低于野生株,其遷移速度也低于野生株,說明FliL基因缺失株的群集運動明顯下降,表明FliL基因對普通變形桿菌的群集運動是必不可少的。而在Mot半固體瓊脂培養(yǎng)基上FliL基因缺失株的遷移距離雖略低于野生株,但是遷移速度并沒有明顯不同,表明FliL基因僅在一定程度上影響了細菌的運動能力。
群集細胞可獨特地適應生命體組織器官的表面環(huán)境[24-26],其感知和響應宿主細胞表面環(huán)境的能力是調節(jié)幾種重要致病因子的關鍵[27-28]。群集細胞的分化除了可使細菌進行鞭毛依賴的群集運動外,還可產生其他毒力因子如尿素酶、溶血酶和蛋白酶等,可協(xié)助細菌在膀胱和腎臟器官的定殖與感染[29]。除了作為運動器官外,鞭毛也與細菌致病力緊密相關,鞭毛及其運動性可促進細菌對宿主細胞的黏附與侵襲,參與大分子蛋白質的轉運,在細菌生物被膜形成過程中起重要作用,并且鞭毛與細菌毒力因子的分泌也密切相關。本試驗FliL基因缺失株LD50升高了約100倍,為低致病力菌株,表明FliL基因與細菌毒力緊密相關,FliL基因缺失可降低揚子鱷源普通變形桿菌的毒力。
綜上所述,本試驗結果明確了FliL基因對普通變形桿菌群集運動是必不可少,并在一定程度上影響了細菌的運動能力,FliL基因缺失株與野生株的LD50相差約100倍,表明FliL基因的缺失會影響普通變形桿菌的毒力,為進一步研究揚子鱷源變形桿菌對揚子鱷痛風等疾病奠定基礎。