李建軍，吳素方，白豐璽

肺結(jié)核是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的慢性傳染性疾病，是一種嚴(yán)重威脅人類健康的全球性公共衛(wèi)生疾病。我國(guó)肺結(jié)核發(fā)病率在世界范圍內(nèi)排名第3，近年來隨著耐藥結(jié)核增多及人口流動(dòng)加劇等問題，肺結(jié)核防治依然任重道遠(yuǎn)[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，CXC亞類趨化因子及其配體在強(qiáng)直性脊柱炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[4-6]。CXC趨化因子配體10(CXC chemokine ligand 10，CXCL10)是CXC趨化因子家族成員，CXCL10可與其唯一受體CXC趨化因子受體3[chemokine(C-X-C motif) receptor 3，CXCR3]結(jié)合，主要表達(dá)于輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)CD4+Th1細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等，在機(jī)體免疫反應(yīng)抗MTB感染中發(fā)揮重要作用[7-8]。然而，目前關(guān)于CXCL10、CXCR3與活動(dòng)性肺結(jié)核及CD27+CD4+T細(xì)胞的關(guān)系尚鮮有報(bào)道。本研究通過檢測(cè)活動(dòng)性肺結(jié)核患者血清CXCL10、CXCR3水平，分析其與CD27+CD4+T細(xì)胞水平的關(guān)聯(lián)性及其臨床意義，以期為活動(dòng)性肺結(jié)核發(fā)病機(jī)制及臨床診療研究提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2019年4月至2021年4月我院收治的活動(dòng)性肺結(jié)核患者100例(肺結(jié)核組)。男62例，女38例，年齡18～65(46.59±10.31)歲，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)(23.67±2.45)kg/m2。另選擇同期健康體檢者96名作為對(duì)照組，男59名，女37名，年齡18～67(47.12±10.49)歲，BMI(22.86±2.31)kg/m2。兩組患者性別、年齡、BMI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)：20190305)。所有研究對(duì)象知情同意參與。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)肺結(jié)核組痰涂片細(xì)菌培養(yǎng)顯示結(jié)核桿菌陽性，胸部X線片發(fā)現(xiàn)陽性病灶，符合活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(2)血液標(biāo)本采集前未接受任何治療；(3)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并慢性阻塞性肺疾病、哮喘、慢性支氣管炎癥者；(2)合并嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器功能異常者；(3)合并乙型肝炎性病毒等其他慢性感染性疾病者；(4)合并糖尿病、高血壓及自身免疫性疾病者。

1.3標(biāo)本采集 收集活動(dòng)性肺結(jié)核患者住院次日清晨及同期健康體檢者空腹外周靜脈血6 ml。取其中3 ml于常溫以3 500 r/min(有效離心半徑5 cm)條件離心10 min，分離血清。另3 ml加入Ficoll-Paque plus淋巴細(xì)胞分離液[中國(guó)愛必信(上海)生物科技有限公司]，制備外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。標(biāo)本均立即送檢或置于-80℃冰箱保存待檢。

1.4血清CXCL10、CXCR3、干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清CXCL10、CXCR3、IFN-γ、TNF-α水平，其中CXCL10檢測(cè)試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，CXCR3檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)南京森貝伽生物科技有限公司，IFN-γ和TNF-α檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5PBMC中CD27+CD4+T細(xì)胞水平檢測(cè)[10]取100 μl PBMC懸液，分別加入10 μl抗CD27+PE、10 μl抗CD4+FITC進(jìn)行染色，避光孵育30 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，3 500 r/min(有效離心半徑5 cm)離心5 min后棄上清，最后加入磷酸鹽緩沖液500 μl上機(jī)檢測(cè)。采用FACS Canto II流式細(xì)胞儀(美國(guó))檢測(cè)PBMC中CD4+及其亞群CD27+CD4+T細(xì)胞水平。

2 結(jié)果

2.1兩組血清CXCL10、CXCR3水平比較 肺結(jié)核組患者血清CXCL10、CXCR3水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清CXCL10、CXCR3水平比較

2.2兩組PBMC中CD27+CD4+T細(xì)胞水平比較

肺結(jié)核組PBMC中CD27+CD4+T細(xì)胞占總CD4+T細(xì)胞的比例低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(22.65±2.53)% vs (41.57±5.32)%；t=31.997，P=0.000]。

2.3兩組血清IFN-γ、TNF-α水平比較 肺結(jié)核組患者血清IFN-γ、TNF-α水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組血清IFN-γ、TNF-α水平比較

2.4活動(dòng)性肺結(jié)核患者血清各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，活動(dòng)性肺結(jié)核患者血清CXCL10與CXCR3、IFN-γ、TNF-α水平呈正相關(guān)(P<0.05)，與PBMC中CD27+CD4+T細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。血清CXCR3水平與血清IFN-γ、TNF-α水平呈正相關(guān)(P<0.05)，與PBMC中CD27+CD4+T細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 活動(dòng)性肺結(jié)核患者血清各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果

2.5血清CXCL10、CXCR3診斷活動(dòng)性肺結(jié)核效能分析結(jié)果 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清CXCL10、CXCR3均具有診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的應(yīng)用價(jià)值(P<0.05)，截?cái)嘀捣謩e為105.53 ng/L、295.72 ng/L。聯(lián)合兩個(gè)指標(biāo)可進(jìn)一步提高診斷活動(dòng)性肺結(jié)核效能，靈敏度和特異度分別達(dá)94.00%、91.70%。見表4，圖1。

表4 血清CXCL10、CXCR3診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的ROC曲線分析結(jié)果

圖1 血清CXCL10、CXCR3診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的ROC曲線圖

3 討論

3.1MTB已經(jīng)進(jìn)化出先天性和適應(yīng)性免疫逃避機(jī)制，以避免機(jī)體免疫介導(dǎo)的清除，這使得MTB能夠建立進(jìn)行性或潛伏性感染，并在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期生存，即使在免疫功能正常的機(jī)體中也是如此[11-12]。有研究顯示，通過與MTB接觸而激活的巨噬細(xì)胞會(huì)分泌多種炎癥介質(zhì)，如TNF-α、白細(xì)胞介素-6等，影響炎癥的發(fā)生、發(fā)展[13]?；顒?dòng)性肺結(jié)核主要是由于機(jī)體感染MTB后，免疫系統(tǒng)防御能力下降，臨床癥狀顯著，需要治療且危害大。

3.2趨化因子及其受體與多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，目前已發(fā)現(xiàn)約50種，其中針對(duì)CXC亞類和CC亞類的研究居多[14]。CXCL10可由IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生，而CXCR3是其唯一受體，二者均可表達(dá)于CD4+Th1細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，CXCL10與CXCR3結(jié)合后可參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及炎癥等多種生理、病理過程[15-16]。有研究顯示，阻斷CXCR3/CXCL10軸對(duì)免疫蛋白酶體功能障礙引起的炎癥有明顯的改善效果，CXCR3/CXCL10軸可作為治療蛋白酶體相關(guān)自身炎癥綜合征的分子靶點(diǎn)[17]。有動(dòng)物及人體研究實(shí)驗(yàn)顯示，CXCL10在神經(jīng)病理性小鼠及人體血清中均異常增加，可考慮作為診斷病理疼痛標(biāo)志物[18]。趙嘉英等[19]研究報(bào)道，與健康對(duì)照組比較，干燥綜合征患者血清CXCL10、CXCR3水平顯著升高，與患者T淋巴細(xì)胞亞群異常有關(guān)，且對(duì)診斷干燥綜合征有較高的靈敏度和特異度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，肺結(jié)核組患者血清CXCL10、CXCR3水平顯著升高，提示血清CXCL10、CXCR3水平升高可能與活動(dòng)性肺結(jié)核發(fā)生有關(guān)。故當(dāng)臨床檢測(cè)血清CXCL10、CXCR3發(fā)生異常時(shí)，可以進(jìn)一步根據(jù)患者臨床癥狀、胸部X線檢查結(jié)果等診斷活動(dòng)性肺結(jié)核。

3.3CXCL10與其受體CXCR3結(jié)合還可趨化T淋巴細(xì)胞活化，與Th1淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)有關(guān)。林秋萍等[20]研究報(bào)道，在CXCL10趨化因子作用下，可使大量Th1細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞活化并分泌IFN-γ、TNF-α等炎癥因子，加大狼瘡腎炎中腎損害作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，肺結(jié)核組患者PBMC中CD27+CD4+T細(xì)胞水平降低，與血清CXCL10、CXCR3水平呈負(fù)相關(guān)；血清IFN-γ、TNF-α水平升高，與血清CXCL10、CXCR3水平呈正相關(guān)。CD27分子是TNF受體超家族成員，可穩(wěn)定表達(dá)于T細(xì)胞表面，與其配體結(jié)合后可調(diào)節(jié)B細(xì)胞活化，促進(jìn)免疫球蛋白合成[21]，CD27+CD4+T細(xì)胞水平降低，提示活動(dòng)性肺結(jié)核患者可能存在T細(xì)胞亞群異常。IFN-γ可通過激活天然免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用，誘導(dǎo)產(chǎn)生CXCL10。而TNF-α是巨噬細(xì)胞分泌小分子蛋白，具有炎癥介質(zhì)作用。綜合以上研究提示，活動(dòng)性肺結(jié)核患者存在免疫異常及炎癥反應(yīng)，血清CXCL10、CXCR3水平升高可能與IFN-γ、TNF-α及CD27+CD4+T細(xì)胞異常有關(guān)。本研究進(jìn)一步以血清CXCL10、CXCR3為檢驗(yàn)變量進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示二者均具有診斷活動(dòng)性肺結(jié)核的應(yīng)用價(jià)值，截?cái)嘀捣謩e為105.53 ng/L、295.72 ng/L，靈敏度和特異度均超過80%。而二者聯(lián)合可進(jìn)一步提高診斷活動(dòng)性肺結(jié)核效能，靈敏度和特異度均達(dá)90%以上，與趙嘉英等[19]的報(bào)道結(jié)果相似，提示血清CXCL10、CXCR3有潛力成為活動(dòng)性肺結(jié)核診療的特異生物標(biāo)志分子。

綜上所述，活動(dòng)性肺結(jié)核患者血清CXCL10、CXCR3水平顯著升高，可能與IFN-γ、TNF-α水平升高及CD27+CD4+T細(xì)胞比例降低有關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)血清CXCL10、CXCR3水平對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核有一定診斷價(jià)值。但本研究樣本量較少，且未能設(shè)置結(jié)核潛伏感染組，故研究結(jié)論尚需進(jìn)一步完善設(shè)計(jì)后進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)于血清CXCL10、CXCR3在活動(dòng)性肺結(jié)核中具體作用機(jī)制及相關(guān)通路值得進(jìn)一步深入探究。