黃正洋，王錢保，李春苗，黃華云，穆春宇，黎壽豐，趙振華

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，江蘇揚(yáng)州 225125)

飼糧纖維是畜禽飼料中普遍存在的功能組分，主要構(gòu)成為纖維素。纖維素是一種天然存在的生物大分子多糖，根據(jù)其溶解度差異，可分為不溶和可溶2種。飼糧纖維主要是不可溶纖維素，它在家禽生產(chǎn)中均有重要的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及生理功能。一方面家禽自身可少量吸收部分飼糧纖維，為家禽生產(chǎn)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；另一方面飼糧中加入粗纖維，由于粗纖維的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，家禽攝入之后可維持腸道正常的結(jié)構(gòu)和功能，避免發(fā)生腸道疾病，提高家禽的抗病性。目前，對(duì)飼糧纖維的研究，主要是集中在家禽對(duì)飼糧纖維的消化吸收方面。飼糧纖維對(duì)家禽免疫性能的影響研究還不夠系統(tǒng)。在哺乳動(dòng)物中飼糧纖維對(duì)機(jī)體免疫性能的影響，主要是通過改善腸道微生物區(qū)系，進(jìn)而提高抗病力和免疫力。在雞中是否也有相同的功能，尚需進(jìn)一步研究。筆者所在課題組前期對(duì)生長(zhǎng)性能統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，4%飼糧纖維可顯著提高試驗(yàn)組家禽生長(zhǎng)性能，降低死亡率，說明飼糧纖維對(duì)家禽的促生長(zhǎng)作用是確定的。相關(guān)研究?jī)?nèi)容已被錄用。

本試驗(yàn)研究不同纖維水平飼糧對(duì)蘇禽3號(hào)肉種雞血清免疫指標(biāo)、盲腸生理結(jié)構(gòu)變化及生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)的影響，旨在探索家禽飼糧中不同比例纖維添加，對(duì)肉種雞免疫及生長(zhǎng)的影響，為生產(chǎn)中低玉米豆粕飼糧開發(fā)提供試驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

本試驗(yàn)于2020年8—10月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽科學(xué)研究所邵伯試驗(yàn)基地進(jìn)行，以中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽科學(xué)研究所選育的蘇禽3號(hào)肉種雞為試驗(yàn)對(duì)象。試驗(yàn)選取體質(zhì)量約1.2 kg，10周齡蘇禽3號(hào)母雞360羽，采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，隨機(jī)分成3組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30羽雞。產(chǎn)蛋雞舍3層階梯籠內(nèi)飼養(yǎng)(每籠1羽)，整個(gè)試驗(yàn)期間，所有雞僅自由飲水，常規(guī)光照和免疫，試驗(yàn)期間為11～21周齡。按對(duì)照組飼喂纖維含量2%基礎(chǔ)日糧(簡(jiǎn)稱2%組)，試驗(yàn)1組飼喂纖維含量4%試驗(yàn)飼糧(簡(jiǎn)稱4%組)，試驗(yàn)2組飼喂纖維含量6%試驗(yàn)飼糧(簡(jiǎn)稱6%組)。

1.2 試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)飼糧由江蘇鹽城源耀飼料有限公司按照試驗(yàn)要求配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。其中，苜蓿原料由寧波聚信瑞宏進(jìn)出口有限公司進(jìn)口，自西班牙苜蓿草顆粒(紫花苜蓿，初花期刈割，250～300 ℃ 熱空氣中處理，快速將苜蓿的濕度降至 8%～12%。再經(jīng)研磨、造粒、冷卻3個(gè)步驟，形成 5～10 mm顆粒)。該苜蓿草顆粒的各營(yíng)養(yǎng)成分為干基蛋白≥16.0%，灰分≤12.0%，粗纖維28.0%，水分11.0%。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.3 血清免疫指標(biāo)的測(cè)定

雞飼養(yǎng)至21周齡時(shí)，每組隨機(jī)選取30羽采集血樣，分離血清，置于-20 ℃中保存。采用雞卵黃免疫球蛋白Y(immunoglobulin Y，IgY)ELISA檢測(cè)試劑盒、雞白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)ELISA檢測(cè)試劑盒、雞白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)ELISA檢測(cè)試劑盒、雞腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-)ELISA檢測(cè)試劑盒、雞干擾素(tumor necrosis factor，IFN-)ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行血清中IgY、IL-2、IL-6、TNF-和TNF-等免疫指標(biāo)的測(cè)定，試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。各個(gè)指標(biāo)具體測(cè)定操作步驟參照試劑盒說明書。

1.4 盲腸結(jié)構(gòu)分析

分離各組試驗(yàn)雞腸道組織，采取盲腸中段約 1 cm，放入10%中性福爾馬林溶液中固定24 h后，換固定液修整樣品繼續(xù)固定備用。所有腸道樣品經(jīng)處理，采用萊卡切片機(jī)沿腸管長(zhǎng)軸垂直方向切片，每腸段切3片，HE染色，中性樹膠封片觀察。采用Image-ProPlus 5.0圖像分析軟件系統(tǒng)測(cè)量盲腸的絨毛高度、隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度/隱窩深度的比值。絨毛高度以絨毛頂端至絨毛基部為準(zhǔn)；隱窩深度為腸腺底部至兩絨毛之間基部開口處的距離。選取多點(diǎn)后取平均值，然后進(jìn)行整理及統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 總RNA抽提與cDNA合成

采用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取各個(gè)組織總RNA，加入DNase Ⅰ去除可能存在的基因組DNA，采用NanoDrop濃度儀測(cè)定RNA濃度，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，確定總RNA完整度且純度符合試驗(yàn)要求后，方可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。取2 μg總RNA，根據(jù)Quant cDNA第1鏈合成試劑盒以O(shè)ligo dT為引物合成cDNA第1鏈。動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒、Quant cDNA第1鏈合成試劑盒、Talent熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)，均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.6 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中雞肌肉生長(zhǎng)抑制素基因(基因)、成肌分化抗原1()基因、配對(duì)盒7()基因和生長(zhǎng)激素()基因序列，利用Primer 6.0和Oligo 7.0設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，以基因?yàn)閮?nèi)參基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，相關(guān)引物信息見表2。

表2 試驗(yàn)中使用到的RT-qPCR引物

1.7 基因組織表達(dá)分析

采用Trizol Reagent提取卵巢、心臟、肝臟和胸肌組織總RNA，加入DNA酶去除基因組DNA，NanoDrop濃度儀測(cè)定其濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，待分析表明符合要求后，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。取2 μg總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明以O(shè)ligo dT為引物合成cDNA第1鏈。

分別對(duì)基因、基因、基因和基因序列進(jìn)行組織表達(dá)分析。qRT-PCR擴(kuò)增體系和程序參照定量試劑盒推薦。PCR反應(yīng)在Applied Biosystems 7 500熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行，作為內(nèi)參，每個(gè)樣本重復(fù)3次，采用2-ΔΔ計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS 26一般線性模型GLM過程的one-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，以<0.05作為差異顯著，<0.01作為差異極顯著。試驗(yàn)結(jié)果采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧纖維水平對(duì)蘇禽3號(hào)對(duì)血清免疫指標(biāo)的影響

由表3可知，飼糧中添加纖維對(duì)蘇禽3號(hào)肉種雞血清免疫指標(biāo)的影響。隨著飼糧纖維水平升高，IgY、IL-2和TNF-含量均呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，4%組血清中IgY、IL-2和TNF-含量顯著低于對(duì)照組(2%組)和6%組(<0.05)；IL-6和TNF-含量呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)，6%組血清中IL-6和TNF-含量顯著低于4%組(<0.05)。

表3 飼糧纖維水平對(duì)蘇禽3號(hào)血清免疫指標(biāo)的影響

2.2 飼糧纖維水平對(duì)蘇禽3號(hào)盲腸結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，添加飼糧纖維水平可改善蘇禽3號(hào)的盲腸腸道結(jié)構(gòu)形態(tài)，絨毛形態(tài)更加完整，邊界更加清晰，絨毛完整度更高，切片碎片較少。由表4可知，隨著飼糧纖維水平的提高，盲腸絨毛高度先下降后增加，隱窩深度變淺，絨毛高度/隱窩深度比值呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)(<0.05)，6%組比值最大。

表4 飼糧纖維水平對(duì)蘇禽3號(hào)盲腸結(jié)構(gòu)的影響

2.3 飼糧纖維水平對(duì)蘇禽3號(hào)生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

飼糧纖維水平對(duì)蘇禽3號(hào)生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)的影響結(jié)果，由圖2可知，隨著飼糧中纖維水平的提高，與對(duì)照組相比，4%組和6%組中基因、基因和基因在肝臟和胸肌中表達(dá)量均較高。隨著飼糧纖維水平的上升，基因表達(dá)量在胸肌組織中顯著高于對(duì)照組(<0.05)，在肝臟組織中，4%組顯著高于對(duì)照組和6%組(<0.05)，在卵巢和心臟中沒有明顯差異(>0.05)。在肝臟組織中，基因在4%組表達(dá)水平最高，其他組織變化沒有達(dá)到顯著水平(>0.05)，基因和基因變化趨勢(shì)相似?；蛟谛丶≈?%組和6%組表達(dá)量顯著升高(<0.05)，且在卵巢中4%組表達(dá)量顯著高于其他組別(<0.05)。

3 討論

3.1 飼糧纖維水平對(duì)蘇禽3號(hào)血清免疫指標(biāo)的影響

畜禽血清中抗體水平高低是評(píng)估其免疫狀況的重要指標(biāo)之一，在現(xiàn)有研究中，主要通過檢測(cè)相關(guān)免疫指標(biāo)變化，來評(píng)價(jià)某些添加劑對(duì)家禽免疫性能的影響。楊仕柳等通過在飼糧中添加不同比例的殼聚糖飼用微生物制劑來飼喂湘黃雞，發(fā)現(xiàn)飼糧中添加殼聚糖可促進(jìn)免疫器官發(fā)育，提高了試驗(yàn)雞群的抗病力。李海燕等研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加0.8%樺褐孔菌發(fā)酵產(chǎn)物，能促進(jìn)雞生產(chǎn)和免疫性能。郭曉秋等以河南固始雞為試驗(yàn)素材，添加不同劑量女貞子水煎劑，發(fā)現(xiàn)添加0.1%、0.2%女貞子水煎劑可顯著提高固始雞新城疫抗體效價(jià)。張慧輝通過提取紫花苜蓿中的水溶性苜蓿多糖，以不同途徑飼喂試驗(yàn)動(dòng)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水溶性苜蓿多糖顯著促進(jìn)了免役器官發(fā)育，提高了T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，提示不同類型的飼料纖維，均可提高試驗(yàn)對(duì)象的免疫性能表現(xiàn)。本研究通過添加纖維，探討對(duì)蘇禽3號(hào)肉種雞血清生免疫指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著飼糧纖維水平的升高，IgY、IL-2和 TNF-均呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，4%組的血清中IgY、IL-2和TNF-含量顯著低于對(duì)照組和試驗(yàn)2組(<0.05)，提示飼糧中添加纖維后，促進(jìn)了蘇禽3號(hào)免疫性能提升，但是纖維水平繼續(xù)提高至6%，相應(yīng)指標(biāo)反而下降，提示太高的纖維水平不利于試驗(yàn)雞免疫性狀的持續(xù)改善，其原因可能是過高的纖維水平，使得飼糧營(yíng)養(yǎng)含量迅速降低，動(dòng)物攝入營(yíng)養(yǎng)的效率大大降低，從而使得免疫性狀下降。

3.2 飼糧纖維水平對(duì)蘇禽3號(hào)盲腸結(jié)構(gòu)的影響

盲腸是家禽大腸的重要組成部分，具有多種生理功能。它不僅能夠吸收營(yíng)養(yǎng)、調(diào)節(jié)滲透壓、合成維生素，還能夠承擔(dān)細(xì)菌發(fā)酵、機(jī)體有益細(xì)菌庫(kù)和輔助免疫反應(yīng)。盲腸的重要生理功能，在不同動(dòng)物上均有研究。周金星等研究不同劑量的黨參、淫羊藿提取物對(duì)青腳麻雞盲腸組織結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)二者的提取物可增強(qiáng)青腳麻雞盲腸黏膜的正常免疫屏障結(jié)構(gòu)。楊建平等研究了飼料中添加復(fù)合植物精油對(duì)58周齡海蘭褐蛋雞腸道菌群的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加復(fù)合植物精油提高了盲腸擬桿菌門的相對(duì)豐度，改善了腸道菌群結(jié)構(gòu)。任敏敏等研究了不同纖維水平對(duì)金華豬盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提高纖維水平可提高盲腸中擬桿菌目S24-7菌屬等細(xì)菌的相對(duì)豐度，改善平均日增重。纖維水平地升高，對(duì)于家禽來說，屬于一種外來刺激，會(huì)誘導(dǎo)腸道特別是家禽細(xì)菌庫(kù)盲腸內(nèi)相關(guān)纖維分解菌數(shù)量增加。本研究也發(fā)現(xiàn)，一定比例的纖維素，會(huì)刺激腸道做出反應(yīng)，有利于機(jī)體免疫性能的增強(qiáng)，但是當(dāng)纖維素比例過高，反而會(huì)導(dǎo)致機(jī)體腸道黏膜受損，絨毛形態(tài)變化，免疫性能下降。在本研究中，添加4%飼糧纖維水平，觀察到盲腸的腸道結(jié)構(gòu)形態(tài)改善，絨毛形態(tài)更加完整。隨著飼糧纖維水平地提高，盲腸絨毛高度先下降后增加，隱窩深度變淺，絨毛高度/隱窩深度比值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，4%組和6%組的比值顯著高于對(duì)照組。

3.3 飼糧纖維水平對(duì)蘇禽3號(hào)生長(zhǎng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

家禽生產(chǎn)主要是獲取對(duì)人類有用的肉、蛋等物質(zhì)，肌肉生長(zhǎng)對(duì)家禽生產(chǎn)至關(guān)重要。目前，影響家禽生長(zhǎng)的基因很多，此方面研究也很多。毛亮等對(duì)藏雞基因進(jìn)行克隆，并對(duì)其組織表達(dá)變化進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在腿肌、胸肌、心臟、腎臟、睪丸、卵巢和胃中均檢測(cè)到基因表達(dá)，脂肪、肝臟和肺中未檢測(cè)到。張冉等對(duì)濟(jì)寧百日雞、萊蕪黑雞和汶上蘆花雞基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同品種及不同發(fā)育階段表達(dá)變化間存在差異。本研究發(fā)現(xiàn)，基因在胸肌、卵巢、心臟及肝臟中均有表達(dá)，并且在胸肌中表達(dá)最高，且隨著飼糧中纖維水平地提高，表達(dá)水平也隨之提高，4%組和6%組顯著高于2%組(對(duì)照組)?；蚴悄壳把芯孔疃嗟男笄萆L(zhǎng)相關(guān)基因，已明確了其具有促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)的作用。何琦等檢測(cè)了不同脛長(zhǎng)性狀雞種中的基因表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)了在同一品種中，腿肌組織中表達(dá)量最高，本研究中雖然沒有檢測(cè)腿肌組織，但是檢測(cè)了同為骨骼肌的胸肌組織，發(fā)現(xiàn)基因在本研究檢測(cè)的組織中表達(dá)量也是最高?；蚴巧≌{(diào)節(jié)因子家族重要的成員之一，它對(duì)骨骼肌的發(fā)生、分化和成熟起著決定性的作用。張久盤等對(duì)固原雞個(gè)體發(fā)育過程中基因組織表達(dá)變化進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因在肌肉組織中表達(dá)量極顯著高于其他組織，并且在胸肌中的表達(dá)量高于腿肌中。但在本研究中發(fā)現(xiàn)，在肝臟組織中基因有較高的表達(dá)量，在胸肌中表達(dá)量?jī)H達(dá)其他組織的平均水平，這可能與試驗(yàn)品種和試驗(yàn)條件相關(guān)。基因是調(diào)控骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的重要的轉(zhuǎn)錄因子。張鎖檢測(cè)了基因不同發(fā)育階段的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在不同組織各個(gè)發(fā)育階段廣泛表達(dá)，且在各常見組織如心臟、肝臟、胸肌和小腸等中表達(dá)量均較高。本研究也發(fā)現(xiàn)，基因在肝臟、胸肌和心臟等組織中表達(dá)量均較高，生長(zhǎng)相關(guān)基因在肌肉組織中均有較高表達(dá)。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，飼糧纖維水平由2%提高至4%，可提高蘇禽3號(hào)免疫性能，增強(qiáng)盲腸絨毛形態(tài)完整，促進(jìn)生長(zhǎng)相關(guān)基因，如基因、基因、基因和基因的表達(dá)；飼糧纖維水平提高至6%，免疫性能與對(duì)照組相比差異不大。