丁 瑋，陽(yáng)樹(shù)英，劉 洋

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128)

鎘是一種生物毒性極強(qiáng)的重金屬元素，近年來(lái)，農(nóng)田土壤鎘污染的情況日趨嚴(yán)重，已成為我國(guó)土壤的首要污染物之一。水稻作為我國(guó)重要的糧食作物，同時(shí)也是喜鎘作物，極易從土壤中吸收累積鎘進(jìn)而通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體造成極大危害。同時(shí)我國(guó)農(nóng)田土壤還存在大量施用化肥導(dǎo)致施用量過(guò)高但利用率低等問(wèn)題。生物炭是一種具有較高表面積、孔隙度、吸附性以及高穩(wěn)定性的富含碳材料，研究發(fā)現(xiàn)，施用生物炭能夠起到促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)的作用，同時(shí)也具有改善土壤結(jié)構(gòu)以及理化性質(zhì)的效果，并且可以使得土壤中重金屬的生物有效性下降，還能夠有效降低水稻稻米對(duì)鎘的吸收量。

土壤微生物參與土壤生態(tài)過(guò)程，在生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中起關(guān)鍵作用，能通過(guò)群落組成和結(jié)構(gòu)變化較敏感地反映土壤條件的改變。反之，土壤的形態(tài)、理化性質(zhì)等因素也會(huì)對(duì)微生物的群落產(chǎn)生影響。生物炭本身具有的特性對(duì)水肥具有良好的吸收保持能力，這也為微生物的生存提供了適宜良好的環(huán)境。王彩云等研究表明，10年連作土壤施入生物炭可顯著提高土壤微生物活性、Shannon指數(shù)和均勻度指數(shù)，同時(shí)顯著提高了土壤微生物對(duì)糖類、氨基酸類、酚酸類和胺類碳源的利用強(qiáng)度。眾多試驗(yàn)結(jié)果表明，施加生物炭可以增加土壤中細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量。殷全玉等在煙地中連續(xù)4年進(jìn)行生物炭施加處理，結(jié)果顯示生物炭的連續(xù)施加能夠?qū)ν寥勒婢娜郝浣Y(jié)構(gòu)起顯著性改善作用，但OTU數(shù)量及α多樣性指數(shù)未發(fā)生顯著性差異。李茂森等在植煙土壤中施加生物炭后，提高了毛霉門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度，降低了子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度。王義祥等研究在酸化茶園土壤中施加生物炭5年后，土壤pH值、可溶性有機(jī)碳含量、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量都得到了提高，Chao指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)隨生物炭用量的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，被孢霉屬、木霉屬、毛殼菌屬的相對(duì)豐度增加，黑盤(pán)孢屬的相對(duì)豐度降低。楊文娜等研究化肥和有機(jī)肥配施生物炭對(duì)土壤磷酸酶活性和微生物群落的影響，結(jié)果表明，化肥和有機(jī)肥配施生物炭可增加果園植株根際土壤的酶活性以及根際和非根際土壤中和基因的多樣性。在化肥配施生物炭處理的研究中，楊浩鵬等研究表明，生物炭配施化肥處理不僅可以緩解化肥單獨(dú)使用帶來(lái)的負(fù)面效果，同時(shí)可達(dá)到肥料肥力合理釋放，化肥減量增效的效果。

已有研究證實(shí)，生物炭因自身具有多孔徑結(jié)構(gòu)以及自身強(qiáng)大的吸附力，使鎘轉(zhuǎn)化為沉淀，減少了土壤中鎘的影響。另外，生物炭增加了土壤pH值，意味著土壤中鎘的活性也會(huì)降低。生物炭配施化肥能夠進(jìn)一步有效地對(duì)土壤中的重金屬起到鈍化作用，并促進(jìn)作物生長(zhǎng)。但目前關(guān)于生物炭及化肥減量配施生物炭對(duì)鎘污染土壤的研究較少，尤其是對(duì)其土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究設(shè)計(jì)一年期大田試驗(yàn)，采用單施生物炭以及化肥減量配施生物炭等不同處理，采用高通量測(cè)序技術(shù)，以期明確不同處理對(duì)于土壤理化指標(biāo)以及土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，為單施生物炭以及化肥減量配施生物炭修復(fù)鎘污染土壤以及水稻安全生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)地概況

于2019年在湖南省瀏陽(yáng)市永安鎮(zhèn)甘家屋農(nóng)技站一塊鎘污染農(nóng)田土壤上進(jìn)行一年期試驗(yàn)，該地地處113°17′E，28°15′N，永安鎮(zhèn)全年平均氣溫為 17.3 ℃，全年平均降水量為1 171.6 mm，水稻田土壤為潮泥土，土壤pH值為5.62，土壤初始鎘含量為0.53 mg/kg。水稻品種采用湘早秈45，供試生物炭采用稻殼生物炭，制備方式是將稻殼在500 ℃下進(jìn)行高溫?zé)峤? h，生物炭基本化學(xué)性狀：pH值為10.4，含碳量為512 g/kg，含氮量為7.8 g/kg，其他元素合計(jì)為480 g/kg，容重為 0.16 g/cm。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)6個(gè)不同處理，分別為空白對(duì)照組(CK)，單施生物炭T1處理(30 t/hm)、T2處理(60 t/hm)，單施化肥處理(CKJ)、化肥減量配施生物炭T1J處理(生物炭30 t/hm)、T2J處理(生物炭60 t/hm)，不同處理重復(fù)3次。生物炭及化肥的具體施用量見(jiàn)表1，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每小區(qū)42 m(6 m×7 m)。在水稻移栽前，一次性通過(guò)人工翻耕處理施入不同生物炭量。施肥前田間各小區(qū)田埂提前均采用耐用的黑色塑料薄膜將土壤進(jìn)行覆蓋包裹處理，目的是為了防止不同處理之間發(fā)生竄肥竄水的情況，試驗(yàn)地其他農(nóng)作管理制度和措施均遵守當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)管理制度。

表1 不同處理生物炭與肥料施用量

利用工具取土鉆在水稻收割前收集0～15 cm土層樣品，5點(diǎn)土樣法取樣后迅速混勻，取其中部分采用聚乙烯自封袋分裝，放入冰盒，委托諾禾致源生物科技有限公司進(jìn)行ITS1高通量測(cè)序；剩余的部分土樣風(fēng)干后進(jìn)行過(guò)篩處理留存，用于檢測(cè)土壤理化性狀。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 土壤真菌總DNA的提取 土壤真菌總DNA的提取，采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)方法進(jìn)行，再采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)提取后的DNA樣品的完整性，以無(wú)菌水稀釋濃度至 1 ng/μL。

1.3.2 真菌高通量測(cè)序 PCR擴(kuò)增是將稀釋后的基因組DNA作為模板，引物采用的是ITS1區(qū)帶有Barcode的特異性引物。使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒(賽默飛世爾科技公司)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，通過(guò)Qubit定量檢測(cè)，結(jié)果合格后采用Ion S5TMXL(賽默飛世爾科技公司)上機(jī)測(cè)序。

1.3.3 土壤理化性狀測(cè)定 土壤pH值采用pH計(jì)PHS-3E型(上海雷磁)測(cè)定；土壤有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量法測(cè)定；土壤碳、氮含量的測(cè)定使用元素分析儀(德國(guó)Elementar)；土壤鎘、鎂、鉀消解后采用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICAP7200)測(cè)量含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以97%的一致性聚類OTU后進(jìn)行物種注釋，使用Qiime軟件對(duì)土壤微生物多樣性進(jìn)行計(jì)算，并將結(jié)果進(jìn)行α多樣性分析；采用IBM SPSS 21.0進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析；采用R語(yǔ)言分析對(duì)土壤理化性質(zhì)以及土壤優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)群落間進(jìn)行冗余分析；采用Duncan’s檢驗(yàn)進(jìn)行多重差異顯著分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

通過(guò)高通量測(cè)序，經(jīng)過(guò)質(zhì)控平均得到75 519條有效數(shù)據(jù)，從圖1可以看出，6個(gè)不同處理的樣品隨序列量的增加，OTU數(shù)目在快速上升后逐漸趨向于平坦，說(shuō)明雖然存在有小部分低豐度類群未被覆蓋的情況，但是此結(jié)果已涵蓋絕大部分物種信息。從表2可以看出，不同處理?xiàng)l件下的樣品覆蓋率結(jié)果顯示均在98.90%以上，表明數(shù)據(jù)結(jié)果能夠?qū)颖就寥勒婢郝浣M成達(dá)到基本反映。

對(duì)土壤樣品進(jìn)行α多樣性分析，結(jié)果(表2)表明，T1、T2、T1J處理較對(duì)照降低了Simpson指數(shù)，但差異不顯著。生物炭配施化肥T2J處理較對(duì)照處理提高了Shannon指數(shù)，但差異不顯著。Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)在處理后無(wú)顯著性差異，表明生物炭及配施化肥未顯著改變土壤真菌群落多樣性及豐富度。

表2 不同處理土壤樣品真菌群落多樣性指數(shù)分析

2.2 真菌群落結(jié)構(gòu)分析

門(mén)水平上不同處理真菌的相對(duì)豐度見(jiàn)圖2，排名前10的菌門(mén)分別為子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)、球囊菌門(mén)(Glomeromycota)、Aphelidiomycota、Kickxellomycota、單毛壺菌門(mén)(Monoblepharomycota)、被孢霉門(mén)(Mortierellomycota)、羅茲菌門(mén)(Rozellomycota)、芽枝霉門(mén)(Blastocladiomycota)。真菌的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)(相對(duì)豐度>5%)為子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)。對(duì)生物炭及配施化肥處理后的菌門(mén)相對(duì)豐度變化進(jìn)行分析，擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度在4.1%～28.4%，擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度在生物炭處理及配施化肥處理后呈上升趨勢(shì)，其中T1J處理較對(duì)照組處理相對(duì)豐度顯著上升(<0.05)。壺菌門(mén)的相對(duì)豐度為0.5%～18.5%，T2處理顯著高于CK處理。

2.3 土壤真菌菌落與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

2.3.1 土壤理化性質(zhì)分析 不同處理土壤理化性質(zhì)見(jiàn)表3，單施生物炭T1、T2處理以及化肥減量配施生物炭T1J、T2J處理較對(duì)照組土壤pH值均顯著提高，且隨著生物炭施加量升高而增加，CKJ處理較對(duì)照組土壤pH值顯著降低值。T2J處理較對(duì)照組土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著提高，T2處理顯著提高了土壤碳氮比。T2J處理較對(duì)照組全氮含量顯著提高；土壤全氮含量表現(xiàn)為隨著生物炭施加量的提高而逐漸上升，化肥減量配施生物炭T1J、T2J處理較單施生物炭T1、T2處理全氮含量提高但差異不顯著。土壤全鉀、全鎂含量在生物炭T1、T2處理后顯著性下降，化肥減量配施生物炭T1J、T2J處理較單施生物炭T1、T2處理全鉀含量升高。土壤鎘含量在生物炭處理后隨著生物炭施加量的增大而下降，化肥減量配施生物炭T1J、T2J處理較單施生物炭T1、T2處理鎘含量下降。

表3 不同處理土壤理化性質(zhì)

2.3.2 生物炭及化肥配施處理?xiàng)l件下的土壤真菌群落與土壤理化性質(zhì)的冗余分析 通過(guò)對(duì)不同處理土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行冗余分析，分析結(jié)果見(jiàn)圖3，2個(gè)主要軸特征值分別為50.61%和26.43%，可以對(duì)77.04%的真菌群落變化進(jìn)行解釋。土壤全氮含量、有機(jī)質(zhì)含量與RDA1軸呈正相關(guān)，土壤全鎂、鎘含量與RDA1軸呈負(fù)相關(guān)，土壤碳氮比、pH值與RDA2軸呈正相關(guān)，土壤全鉀含量與RDA2軸呈負(fù)相關(guān)。T2處理與CK處理距離最大，說(shuō)明生物炭T2處理改變了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。土壤pH值、全氮含量及土壤碳氮比對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著影響。

2.3.3 不同處理土壤真菌主要菌群與土壤理化性質(zhì)的Pearson相關(guān)分析 將土壤理化因子與主要真菌群落之間進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，從表4可以看出，其中主要真菌門(mén)共10個(gè)，其中顯示有5個(gè)真菌門(mén)的變化與土壤理化性質(zhì)呈現(xiàn)出顯著性相關(guān)。其中，土壤pH值與壺菌門(mén)呈顯著正相關(guān)；土壤有機(jī)質(zhì)含量與球囊菌門(mén)呈顯著正相關(guān)；土壤全氮含量與子囊菌門(mén)呈顯著正相關(guān)；土壤碳氮比與壺菌門(mén)呈顯著正相關(guān)，與被孢菌門(mén)、芽枝霉門(mén)呈極顯著正相關(guān)。

表4 真菌菌落與土壤理化性狀的Pearson相關(guān)分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

土壤微生物是土壤各項(xiàng)生態(tài)功能的重要參與者，土壤微生物的豐度以及多樣性能夠?qū)ν寥拉h(huán)境的改變產(chǎn)生靈敏的反映，而土壤真菌是有機(jī)物質(zhì)分解和土壤生物量的主要組成部分，在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中十分重要。生物炭配施化肥處理能夠提供更加充足的養(yǎng)分，對(duì)土壤C/N進(jìn)行調(diào)節(jié)，能更大程度地提高有機(jī)物質(zhì)的利用效率，激發(fā)土壤微生物的活性和增加有益菌數(shù)量，同時(shí)生物炭的碳骨架有較好的持水性和通氣性，能夠使得微生物的繁衍擁有更好的生存環(huán)境。本試驗(yàn)結(jié)果表明，單施生物炭處理時(shí)，鎘污染土壤的多樣性及豐富度無(wú)顯著性改變，本結(jié)果與李茂森等的研究結(jié)果一致，而生物炭配施化肥處理較對(duì)照組雖然提高了土壤真菌群落多樣性，但差異不顯著。這種結(jié)果出現(xiàn)的原因可能是真菌大多作為分解者的角色存在于土壤中，但是生物炭作為一種極難分解的惰性碳，短時(shí)間內(nèi)真菌對(duì)于生物炭無(wú)法達(dá)到充分有效的利用。

農(nóng)田土壤真菌群落尤其是優(yōu)勢(shì)類群與耕作土壤類型、耕作措施以及施肥因素等密切相關(guān)。鎘污染稻田土壤的優(yōu)勢(shì)真菌類群是子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)，本結(jié)果與李紅宇等的研究結(jié)果一致。壺菌門(mén)在單施生物炭處理時(shí)相對(duì)豐度顯著性提高，與劉師豆等的研究結(jié)果一致。擔(dān)子菌是土壤中的重要分解者，在土壤中以腐生、寄生和共生的營(yíng)養(yǎng)方式生存，其功能是分解木質(zhì)化植被碎屑，有著很好的分解植物殘?bào)w中的木質(zhì)纖維素的能力，生物炭配施化肥處理能夠較對(duì)照組顯著提高擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度，表明生物炭配施化肥處理能夠?qū)︽k污染土壤理化環(huán)境產(chǎn)生影響，提高部分菌門(mén)的相對(duì)豐度，利于腐生菌群成長(zhǎng)。

通過(guò)RDA分析及Pearson分析進(jìn)一步明確影響群落結(jié)構(gòu)變化的環(huán)境因子，生物炭和化肥的添加改變了真菌群落結(jié)構(gòu)，且高量生物炭處理對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)的影響更為顯著；土壤pH值、全氮含量及土壤碳氮比對(duì)真菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著影響。單施生物炭處理及化肥減量配施生物炭處理顯著降低了鎘污染土壤鎘含量，同時(shí)配施化肥處理，能夠在豐富土壤養(yǎng)分含量的同時(shí)，利用生物炭具有較強(qiáng)的吸附性對(duì)土壤中的P、K、Mg等不同存在形態(tài)的營(yíng)養(yǎng)元素產(chǎn)生吸附作用，豐富了土壤中有效性營(yíng)養(yǎng)元素的含量，為真菌提供養(yǎng)分來(lái)源；同時(shí)，生物炭及化肥配施處理的情況下，土壤pH值得到調(diào)節(jié)，并且土壤中的碳、氮水平在生物炭及化肥的施加處理下，可以調(diào)節(jié)土壤真菌對(duì)其的利用能力，增加土壤相關(guān)酶的活性，從而影響真菌群落結(jié)構(gòu)。

單施生物炭及化肥減量配施生物炭處理能夠降低鎘污染土壤鎘含量，并有助于改善土壤養(yǎng)分。生物炭及配施化肥處理對(duì)土壤真菌群落多樣性及豐富度無(wú)顯著性影響，生物炭配施化肥處理較對(duì)照處理顯著提升了擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度，單施生物炭顯著提高了壺菌門(mén)的相對(duì)豐度。土壤pH值、全氮含量及土壤碳氮比是水稻土壤真菌群落分布的重要影響因素。