劉建欣，劉 蕾，郭珊珊，袁倩云，王文彬

(1.江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇連云港 222005；2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇連云港 222005；3.江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇連云港 222005)

弧菌是革蘭氏陰性嗜鹽菌，在海洋環(huán)境中分布廣泛，是海產(chǎn)品中常見的食源性致病菌。食用致病性弧菌污染的食物通常會(huì)引起急性腸胃炎，重癥患者則表現(xiàn)為脫水、休克昏迷甚至死亡。最常見的致病性弧菌包括副溶血性弧菌()、創(chuàng)傷弧菌()和霍亂弧菌()，其中創(chuàng)傷性弧菌對(duì)魚類的致死率較高，副溶血性弧菌在海鮮中具有更高的流行率。此外，弧菌病是一種重要的海洋水產(chǎn)動(dòng)物病害，已發(fā)現(xiàn)了50多種易感的水產(chǎn)動(dòng)物，危害了海洋水產(chǎn)健康養(yǎng)殖，構(gòu)成了重要的經(jīng)濟(jì)威脅。

弧菌診斷特異性抗原是建立準(zhǔn)確、快速弧菌免疫檢測(cè)手段的基礎(chǔ)，也有助于弧菌病害的防控。外膜蛋白(outer membrane protein，簡(jiǎn)稱Omp)因其基本功能、表面暴露性和在菌株中的保守性，常被用于疫苗的候選抗原。目前，已證實(shí)的弧菌屬保守性和特異性較好的外膜蛋白較少，仍然需要新的弧菌屬外膜蛋白。倫鏡盛等分別重組表達(dá)了5種弧菌的外膜蛋白U(OmpU)，來自副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌和擬態(tài)弧菌()的OmpU的小鼠免疫血清與13種弧菌發(fā)生交叉反應(yīng)，與菌屬外不發(fā)生免疫交叉反應(yīng)，表明OmpU是弧菌保守的候選免疫抗原。副溶血性弧菌外膜蛋白VP1243在弧菌中廣泛分布，具有高度保守性，誘導(dǎo)了對(duì)副溶血弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌的交叉免疫反應(yīng)和免疫保護(hù)，是預(yù)防弧菌感染的多功能疫苗候選蛋白。Li等用同源和異源細(xì)菌免疫小鼠，采用免疫蛋白組學(xué)確定了弧菌外膜蛋白的多價(jià)疫苗候選物，發(fā)現(xiàn)了30～40種弧菌外膜蛋白。其中，重組外膜蛋白A(OmpA)和肽聚糖相關(guān)脂蛋白(Pal)對(duì)溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌和熒光假單胞菌均有免疫保護(hù)作用。

BamA作為跨膜桶狀蛋白具有較好的表面暴露性，是β-桶狀組裝系統(tǒng)(BAM)家族的核心成分，目前在所有已測(cè)序的革蘭氏陰性菌中均有發(fā)現(xiàn)。前期我們建立了生物信息學(xué)方法對(duì)副溶血性弧菌4 831個(gè)編碼蛋白進(jìn)行篩選，獲得了101個(gè)位于外膜的蛋白，并通過表面蛋白質(zhì)組檢驗(yàn)篩選結(jié)果，2種方法均表明BamA是外膜蛋白，且該蛋白在弧菌屬中具有廣泛保守性，具有作為弧菌免疫檢測(cè)抗原的潛力。目前，關(guān)于弧菌BamA的重組表達(dá)及免疫原性的研究未見報(bào)道，其作為診斷抗原和疫苗抗原的價(jià)值仍不清楚。因此，本研究進(jìn)一步對(duì)BamA的保守性和基本結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并通過生物信息學(xué)方法篩選特異性多肽，采用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)和免疫印跡評(píng)價(jià)其免疫BALB/c小鼠后血清與7株副溶血性弧菌、9種常見弧菌、發(fā)光桿菌等海洋細(xì)菌及其他常見細(xì)菌的交叉反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件

本研究所用的菌株詳見表1，于2019年4月在江蘇海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)。原核表達(dá)載體pET-28a(+)為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。副溶血性弧菌(CICC21617)用含3%NaCl的LB培養(yǎng)基(1.0%胰蛋白，0.5%酵母提取物，3.0% NaCl)在37 ℃條件下過夜培養(yǎng)。大腸桿菌DH5α和大腸桿菌BL21作為工程菌株，培養(yǎng)條件為L(zhǎng)B培養(yǎng)基(1.0%胰蛋白，0.5%酵母提取物，1.0% NaCl)37 ℃過夜培養(yǎng)，用于重組質(zhì)粒構(gòu)建和蛋白質(zhì)表達(dá)。將pET-28a(+)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 本研究所用菌株

1.2 主要試劑及儀器

限制性內(nèi)切酶HⅠ和Ⅰ，均購自寶生物工程(大連)有限公司；弗氏完全和不完全佐劑、牛血清蛋白BSA，均購自Sigma公司；沉淀型四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物緩沖液，購自廣州捷倍斯生物科技有限公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、卡那霉素、異丙基--硫代半乳糖苷(IPTG)、DNA Marker、雙色預(yù)染蛋白Marker、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)所需試劑，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；羊抗鼠二抗，購自Jackson ImmunoResearch公司；4--(馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(Sulfo-SMCC)和二甲基甲酰胺(DMF)，購自Jackson ImmunoResearch Laboratories公司；其他化學(xué)試劑均購自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；96孔酶標(biāo)板，購自無錫國(guó)盛生物工程股份有限公司；透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量為14 000)，購自上海橋星貿(mào)易有限公司；酶標(biāo)儀為Infinite F50；半干式轉(zhuǎn)膜儀型號(hào)為AmershamTE 70。

1.3 副溶血性弧菌BamA蛋白拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析及多肽的篩選

副溶血性弧菌的外膜蛋白BamA的氨基酸序列(GI：28899084)從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的蛋白數(shù)據(jù)庫(NCBI)中獲得，并采用搜索比對(duì)工具BLAST分析其與其他弧菌屬弧菌序列的同源性水平。為了直觀分析BamA蛋白在弧菌屬及革蘭氏陰性菌株蛋白之間的關(guān)系，用ClustalX分析蛋白質(zhì)序列的多重比對(duì)，并使用MEGA 7.0中的鄰接(neighbor-joining，簡(jiǎn)稱NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。設(shè)置了10 000次重復(fù)的Bootstrap測(cè)試，以檢查分支拓?fù)涞挠行?。BamA蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)使用SWISS-MODEL同源建模法在線生物信息學(xué)軟件進(jìn)行模擬，將候選蛋白質(zhì)的序列輸入至序列框中，SWISS-MODEL同源建模法可自動(dòng)找到與目標(biāo)序列同源的已知結(jié)構(gòu)作為模板，為目標(biāo)序列與模板序列創(chuàng)建序列比對(duì)，根據(jù)序列比對(duì)，用同源建模軟件預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)模型，評(píng)估模型質(zhì)量。模擬結(jié)構(gòu)同時(shí)通過I-TASSER和TrRosetta進(jìn)行了驗(yàn)證。利用Pymol軟件分析最佳蛋白模型的結(jié)構(gòu)。結(jié)合SnapGene和Proten軟件對(duì)副溶血性弧菌外膜蛋白BamA的保守區(qū)域進(jìn)行分析，篩選出保守且對(duì)弧菌屬物種具有特異性的多肽序列。利用Pymol軟件分析蛋白結(jié)構(gòu)，將在弧菌屬中具高保守性的多肽定位到蛋白結(jié)構(gòu)，找到其中的暴露性表位氨基酸序列。

1.4 BamA重組質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)

利用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium bromide，簡(jiǎn)稱CTAB)法提取DNA，副溶血性弧菌外膜蛋白BamA基因(登錄號(hào)為BA000031.2和BA000032.2)，通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物：5′-C A C G G A T C C A T G G C G A T T A A G C G A A T T C T-3′，下游引物：5′-C C G C T C G A G G A A A G T T C T A C C G A T A G T G A A T-3′。PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 1 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，目的基因和pET-28a(+)質(zhì)粒均用HⅠ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切，并用TDNA連接酶進(jìn)行連接。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，用含有50 μg/mL卡那霉素的LB瓊脂平板，選擇5個(gè)單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因，并通過測(cè)序驗(yàn)證。將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，并保存在加入15%甘油的LB培養(yǎng)基中，-80 ℃ 凍存。

用含有卡那霉素(50 μg/mL)抗性的LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)陽性重組菌株，以1∶100(體積比)加入到LB培養(yǎng)液中，在37 ℃搖床中孵育至為0.5～0.8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG。通過單因素試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)溫度、IPTG濃度(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L)和IPTG誘導(dǎo)時(shí)間。最終培養(yǎng)條件為誘導(dǎo)時(shí)間16 h，溫度16 ℃，誘導(dǎo)劑濃度0.4 mmol/L。4 ℃，5 000 r/min 離心 30 min 收集菌體，用含有2 mol/L尿素和1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，在冰浴中260 W超聲破碎 30 min，超聲開3 s，超聲關(guān)7 s。4 ℃，12 000 r/min 離心20 min，收集上清液和沉淀，然后將沉淀溶于含有8 mol/L尿素的50 mmol/L PBS緩沖液(pH 值為8.0)中。通過10% SDS-PAGE分離膠，用5%濃縮膠研究目標(biāo)蛋白的表達(dá)形式(可溶性表達(dá)或包涵體)。

將8 mol/L尿素溶解后的溶液12 000、4 ℃離心10 min，取上清液。將上清液通過裝有鎳離子親和層析柱(Ni-NTA)進(jìn)行純化，通過優(yōu)化含咪唑的尿素緩沖液梯度純化蛋白，并采用200 mmol/L咪唑洗脫，得到單一條帶。純化后的BamA蛋白，濃度稀釋到0.5 mg/mL，裝入透析袋(截?cái)喾肿恿繛?14 000)中，低溫梯度透析，用磁力攪拌器低速攪拌，透析緩沖液(0.05 mol/L PBS，8 mol/L尿素)濃度從8 mol/L尿素梯度降低至不含尿素的0.01 mol/L PBS緩沖液。蛋白濃度通過Bradford方法確定。蛋白質(zhì)的表達(dá)和純化通過10% SDS-PAGE分離膠進(jìn)行驗(yàn)證，并通過考馬斯亮藍(lán)R-250染色顯示蛋白質(zhì)條帶，制備的重組BamA蛋白在-80 ℃保存，待用。

1.5 多肽偶聯(lián)

采用Sulfo-SMCC作為偶聯(lián)劑，在0.1 mol/L PBS緩沖液中，7 mg 載體蛋白BSA與2.3 mg Sulfo-SMCC 偶聯(lián)，將反應(yīng)的溶液移至10 ku超濾管中，反復(fù)超濾3次以去除多余的Sulfo-SMCC。稱取7 mg多肽于BSA-SMCC體系中，室溫磁力攪拌12 h，將偶聯(lián)完成的溶液裝入透析袋，并通過蛋白電泳表征。

1.6 動(dòng)物免疫

6～8周齡的雄性BALB/c小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院。將純化的BamA可溶蛋白與弗氏完全佐劑等體積乳化后免疫小鼠。小鼠第1次免疫使用的乳化劑為弗氏完全佐劑，之后的加強(qiáng)免疫使用的乳化劑為弗氏不完全佐劑。共免疫4次，首次和第2次免疫劑量為80 μg/只，第3、第4次免疫劑量減半。免疫間隔時(shí)間為3周，免疫方式為小鼠背部皮下多點(diǎn)注射。第3、第4次免疫后1周小鼠尾部采血，獲得血清并于-20 ℃ 保存。

1.7 間接ELISA和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)測(cè)定血清效價(jià)及交叉反應(yīng)

表1中的菌株過夜培養(yǎng)并計(jì)數(shù)后，在100 ℃煮沸15 min滅活并冷卻至室溫。用碳酸鹽緩沖液(pH值為9.6)將菌體濃度稀釋到10CFU/mL，每孔 100 μL 加入到96孔酶標(biāo)板中，37 ℃包被2 h；用含0.05%吐溫-20的磷酸緩沖液(PBST)洗滌3次后，每孔加200 μL含0.2%明膠的碳酸鹽緩沖液封閉酶標(biāo)板，37 ℃封閉 2 h；小鼠血清用抗體稀釋液(PBS緩沖液，0.1%明膠，0.05% Tween-20)稀釋500倍，并以3倍梯度稀釋6個(gè)梯度，并用稀釋液作陰性對(duì)照，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min；用PBST洗板3次；加入用抗稀稀釋4 000倍的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG(0.5 μg/mL)，每孔100 μL，37 ℃孵育30 min；用PBST洗板4次；加入100 μL顯色液，37 ℃孵育10～15 min；50 μL 2 mol/L硫酸溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度。當(dāng)最高稀釋度的陽性血清的與空白對(duì)照的之比(P/N)≥2.1時(shí)，該稀釋度即為血清效價(jià)。

免疫印跡方法參考文獻(xiàn)[15-16]。簡(jiǎn)要步驟為將過夜培養(yǎng)的50 mL菌液離心，棄上清，用15 mL PBS緩沖液將沉淀重懸；采用“1.2.4”節(jié)中的方法冰浴破碎；離心取上清，將細(xì)菌蛋白上樣10 μL至SDS-PAGE電泳儀，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%；電泳完成后用半干轉(zhuǎn)膜儀TE 70將蛋白轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，電流為 30 mA，轉(zhuǎn)膜 30 min；用50 mL含5%脫脂奶粉的(PBS緩沖液)封閉PVDF膜上的多余位點(diǎn)，37 ℃輕輕振蕩2 h；加入20 mL血清稀釋液(稀釋1 000倍數(shù))，室溫孵育1 h；用PBST洗滌3次，每次在搖床輕輕振蕩5 min，加入20 mL抗稀稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(0.5 μg/mL)，室溫避光孵育1 h；洗滌5次，TMB顯色劑顯色5～10 min，有清晰條帶出現(xiàn)后洗滌拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 BamA蛋白保守性及多肽分析

BamA是外膜蛋白組裝復(fù)合體的一部分，它參與β-桶蛋白的組裝及其插入外膜。BamA是Omp85超級(jí)家族的成員，Omp85超級(jí)家族是一組16鏈β-桶狀蛋白，參與細(xì)菌和細(xì)胞器中的膜蛋白插入和蛋白分泌反應(yīng)。圖1-a為大腸桿菌BamA蛋白的結(jié)構(gòu)圖(PDB：5D0O)，圖1-b是以大腸桿菌K12的BamA為模板模擬的副溶血性弧菌BamA蛋白的結(jié)構(gòu)圖，從圖中可知BamA蛋白結(jié)構(gòu)具有β-桶狀結(jié)構(gòu)，具有細(xì)胞外的無規(guī)則卷曲環(huán)區(qū)(由上至下第1條虛線的上方為膜外部分)，說明蛋白具有一定的暴露性。為了進(jìn)一步了解BamA的保守性，選取了具有代表性的弧菌屬蛋白序列與副溶血性弧菌BamA蛋白序列進(jìn)行比對(duì)。同源性分析結(jié)果表明，BamA蛋白在所有弧菌中廣泛分布，較保守，序列一致性在83%以上，與其他革蘭氏陰性細(xì)菌的蛋白序列相似性較低，最高相似度在50%以下，說明BamA蛋白屬內(nèi)保守性較高，具有一定的特異性。

通過NCBI中BLAST與副溶血性弧菌BamA蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)合SnapGene軟件進(jìn)行分析(圖2)，最終選取出相似性在80%以上的連續(xù)氨基酸序列。利用Pymol軟件，將找出的氨基酸序列在模擬蛋白結(jié)構(gòu)中標(biāo)記出來，得到4條保守性較高且位于膜外的表位氨基酸，分別為BamA-1(P1)Y Y Y D Y S D P T N Y R S S、BamA-3(P2)N G Y G Q T D G N D N L F、BamA-4(P3)VYRDYSGSN、BamA-5(P4)QADNIDSSGALNT，位置見圖1-b，這些序列都是 8～13 aa的短肽，分子量為1 163～1 896 u，這些表位具有較高的保守性及較好的暴露性，使得BamA蛋白具有潛在的檢測(cè)價(jià)值及疫苗價(jià)值。

2.2 副溶血性弧菌BamA蛋白的表達(dá)及多肽偶聯(lián)

采用CTAB法從副溶血性弧菌(CICC 21617)中提取DNA，并以此為模板擴(kuò)增出分子量為2 000～3 000 bp 的基因片段(圖3-a)，與BamA基因片段長(zhǎng)度(2 415 bp)一致。將其插入pET-28a(+)中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)雙向測(cè)序后與BamA符合度為100%，確認(rèn)構(gòu)建成功。

采用不同濃度IPTG及誘導(dǎo)時(shí)間誘導(dǎo)BamA蛋白表達(dá)，培養(yǎng)溫度為16 ℃，將超聲破碎后的上清和沉淀經(jīng)SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖3-b所示，在70～100 ku出現(xiàn)過表達(dá)的蛋白條帶，重組質(zhì)粒帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，BamA理論分子量為89 ku，表達(dá)的蛋白位置與理論值較為吻合。IPTG濃度為 0.4 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為6 h時(shí)，可溶性蛋白表達(dá)量較高，但后期純化時(shí)回收率較低，蛋白BamA最終以包涵體形式制備，誘導(dǎo)條件為16 ℃培養(yǎng)，IPTG濃度為 0.4 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為16 h。

為了將多肽與載體蛋白偶聯(lián)形成完全抗原，所有多肽的N端均用半胱氨酸修飾。通過SDS-PAGE表征偶聯(lián)情況，如圖4-a所示，BSA蛋白條帶在與Sulfo-SMCC連接后移至更高的位置(泳道2)，與多肽反應(yīng)后蛋白條帶進(jìn)一步上移，說明分子量進(jìn)一步增加(泳道3至泳道6)，多肽偶聯(lián)成功。

采用Ni-NTA親和層析柱純化包涵體蛋白，對(duì)柱子的洗脫采用濃度為8 mol/L的尿素緩沖液，其所含咪唑濃度分別是5、10、200、300 mmol/L。如圖4-b所示，在咪唑濃度為200 mmol/L時(shí)可以在90 ku左右得到清晰的單一蛋白條帶?？扇苄缘鞍着c包涵體蛋白相比具有正確的折疊結(jié)構(gòu)，存在著較好的功能性。因此，對(duì)BamA包涵體蛋白進(jìn)行純化和尿素梯度透析復(fù)性，透析復(fù)性設(shè)置的尿素濃度梯度分別為8.0、6.0、4.0、3.0、2.0、1.5、1.0、0.5 mol/L，隨后又進(jìn)行了0.05 mol/L PBS和 0.01 mol/L PBS的透析，透析袋中無可見沉淀，提示復(fù)性成功。

2.3 免疫血清評(píng)價(jià)

蛋白抗原在第3次免疫后，用間接ELISA方法檢測(cè)小鼠血清對(duì)免疫抗原的效價(jià)，結(jié)果見圖5?？v軸表示450 nm處吸光度，橫軸表示測(cè)試菌株，血清稀釋500倍。BamA免疫血清對(duì)BamA重組蛋白的平均吸光度為2.121，與副溶血性弧菌CICC10552等包板時(shí)的平均吸光度為0.428，與哈維氏弧菌等弧菌屬包板的平均吸光度為0.345；對(duì)美人魚發(fā)光桿菌等弧菌屬外細(xì)菌的平均吸光度為0.155。BamA蛋白免疫血清對(duì)弧菌及其他細(xì)菌菌體效價(jià)大多僅為0.5 K，而對(duì)BamA重組蛋白的效價(jià)高達(dá)121.5 K。說明免疫過程誘導(dǎo)產(chǎn)生了BamA重組蛋白的抗體，但血清與菌體的識(shí)別性較弱。BamA蛋白多肽P1、P2、P3、P4免疫血清對(duì)BamA重組蛋白的平均吸光度為2.058、0.625、1.222、1.184，與副溶血性弧菌包板的平均吸光度分別為0.344、0.478、0.243、0.278，對(duì)哈維氏弧菌等弧菌屬包板的平均吸光度分別為0.302、0.361、0.213、0.232，對(duì)美人魚發(fā)光桿菌等弧菌屬外包板平均吸光度為0.173，結(jié)果表明免疫血清與菌屬外幾乎無交叉反應(yīng)。BamA多肽免疫血清對(duì)BamA蛋白的效價(jià)為13.5 K，而對(duì)弧菌及其他細(xì)菌菌體的效價(jià)大多為 0.5 K，表明選取的多肽位于BamA蛋白表面，受空間結(jié)構(gòu)影響并不大，但免疫血清與菌體的識(shí)別性同樣較弱。

為驗(yàn)證血清的結(jié)合蛋白和交叉反應(yīng)，采用免疫印跡進(jìn)行進(jìn)一步分析。由圖6可知，BamA蛋白血清與7株副溶血性弧菌以及9株其他弧菌的全菌蛋白在70～100 ku出現(xiàn)顯色條帶，其中對(duì)副溶血性弧菌CICC 21618及非O1型霍亂弧菌反應(yīng)較弱，識(shí)別位置與副溶血性弧菌外膜蛋白BamA(89 ku)分子量大小一致，對(duì)弧菌屬外的全菌蛋白多數(shù)不反應(yīng)，只對(duì)霍氏格里蒙特氏菌有反應(yīng)，但在全菌ELISA中未觀察到與霍氏格里蒙特氏菌有交叉反應(yīng)的。免疫印跡結(jié)果說明BamA重組蛋白免疫血清能與大部分弧菌的BamA蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)，BamA蛋白在弧菌屬具有較高的保守性和特異性。

3 討論與結(jié)論

弧菌是一種水產(chǎn)動(dòng)物和人類共患的條件致病菌，其引起的細(xì)菌性病害給我國(guó)南美白對(duì)蝦、海產(chǎn)魚類等水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。細(xì)菌外膜蛋白的序列部分暴露于細(xì)胞外環(huán)境，這些膜外多肽結(jié)構(gòu)不僅使外膜蛋白質(zhì)具有基本的生理或病理功能，也可以誘導(dǎo)特定的免疫反應(yīng)。

外膜蛋白是否可用作潛在的檢測(cè)抗原和疫苗抗原應(yīng)考慮多種因素，包括表面暴露、菌株間的保守性和誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力。β-桶狀外膜蛋白通常是跨膜或是嵌入細(xì)胞膜內(nèi)，在細(xì)胞質(zhì)中合成后，通過分泌系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜上的β-桶狀組裝系統(tǒng)(BAM)上，并完成組裝和在細(xì)胞膜上的定位。在革蘭氏陰性細(xì)菌中，BAM復(fù)合物參與細(xì)胞外膜蛋白運(yùn)送和安裝過程，負(fù)責(zé)將合成的外膜蛋白插入并折疊到細(xì)菌胞膜。BAM家族蛋白具有較好的保守性，其中BamA是該系統(tǒng)的核心并且在細(xì)胞外膜具有較好的暴露性，其他BamB、BamC、BamD均位于細(xì)胞外膜的膜內(nèi)，BamA由嵌入外膜的C末端β-桶和周質(zhì)N末端區(qū)域組成，該區(qū)域包含多個(gè)與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的表位。對(duì)副溶血性弧菌BamA蛋白進(jìn)行基于弧菌菌株之間的保守性分析結(jié)果表明該蛋白具有較高保守性，與常見弧菌序列一致性達(dá)到83%，與屬外常見菌序列一致性低于50%。

通過小鼠模型研究了弧菌副溶血性弧菌BamA重組蛋白及多肽抗原的免疫原性。BamA重組蛋白經(jīng)純化獲得包涵體蛋白并成功復(fù)性，制備的BamA重組蛋白與天然蛋白具有更為接近的結(jié)構(gòu)。免疫血清測(cè)試結(jié)果表明，BamA重組蛋白的抗體可與常見弧菌及其全菌蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。免疫印跡中，重組BamA蛋白和弧菌超聲破碎裂解物出現(xiàn)的目的條帶位置相同，說明菌體與血清的抗原結(jié)合位點(diǎn)也為BamA蛋白。免疫血清與7種副溶血性弧菌和9種測(cè)試弧菌全菌蛋白發(fā)生不同程度的特異性結(jié)合，而與美人魚發(fā)光桿菌、費(fèi)氏另類弧菌、嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、大腸桿菌、陰溝腸桿菌、無丙二酸檸檬酸桿菌沒有交叉反應(yīng)，僅與霍氏格里蒙特氏菌出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶?；羰细窭锩商厥暇腔【浦械囊环N致病菌，2003年前分類屬于弧菌屬，名為霍利斯弧菌()，可引起人類腸胃炎。因此，與該菌蛋白的反應(yīng)主要由于較近的親緣關(guān)系。值得一提的是，本試驗(yàn)采用的弧菌屬菌株較為廣泛，且具有代表性，包含了對(duì)人類具有致病性的霍亂弧菌、溶藻弧菌、擬態(tài)弧菌，及對(duì)水生物具有致病性的鰻弧菌和哈維氏弧菌。

ELISA和免疫印跡的結(jié)果表明，BamA蛋白和多肽免疫血清對(duì)BamA蛋白具有較強(qiáng)的結(jié)合，但與不同副溶血性弧菌菌體的結(jié)合均較弱。免疫印跡是菌體破碎后的蛋白與免疫血清直接反應(yīng)，而ELISA則是用菌體包板，ELISA中菌體與外膜蛋白BamA免疫血清結(jié)合較差提示抗原抗體的結(jié)合可能受到了菌體表面其他抗原的影響。革蘭氏陰性菌表面存在有莢膜和脂多糖(LPS)等抗原，其中莢膜是副溶血性弧菌等弧菌主要的表面抗原，細(xì)菌莢膜長(zhǎng)度為0.2～0.5 μm，可以掩蓋抗體與菌體外膜蛋白的結(jié)合，抵抗宿主免疫系統(tǒng)的殺傷。Vij等研究發(fā)現(xiàn)，采用菌體免疫結(jié)合重組BamA蛋白加強(qiáng)免疫的方法制備了81個(gè)大腸桿菌BamA單克隆抗體，其中7個(gè)抗體可以對(duì)大腸桿菌K12(缺失核心多糖)和LPS核心多糖突變株(ΔwaaD)有90%以上的抑制生長(zhǎng)率，證明了BamA為大腸桿菌的外膜蛋白并具有中和性抗原表位，但正常大腸桿菌完整的LPS結(jié)構(gòu)限制了抗體與BamA的接觸而不被BamA抗體識(shí)別。后續(xù)研究可通過設(shè)計(jì)突變菌株研究免疫血清與副溶血性弧菌的結(jié)合，驗(yàn)證是否存在莢膜、脂多糖等表面抗原的影響。這也提示篩選外膜蛋白作為診斷抗原和疫苗抗原，除了應(yīng)位于外膜，具有一定保守性、特異性，還應(yīng)該考慮其在其他抗原影響下的表面暴露性。

綜上，本研究首次報(bào)道了副溶血性弧菌外膜蛋白BamA重組質(zhì)粒的構(gòu)建、重組蛋白的表達(dá)純化、多肽的篩選和偶聯(lián)，以及BamA抗原在小鼠中的免疫原性。ELISA和免疫印跡的結(jié)果表明，免疫血清與弧菌屬菌體蛋白存在交叉反應(yīng)，與遲緩愛德華氏菌等弧菌屬外細(xì)菌蛋白無交叉反應(yīng)，血清與弧菌菌體的結(jié)合效價(jià)較低，可能與弧菌表面莢膜等其他表面抗原的影響有關(guān)。該研究證明了弧菌BamA具有弧菌屬保守性和良好的特異性，但表面可暴露性可能較為有限，這為后續(xù)驗(yàn)證研究指明了方向，也為弧菌屬免疫檢測(cè)抗原和疫苗抗原開發(fā)提供了新的影響因素和研究思路。