方志偉，楊小明，楊 陽，魏曉松，易成智，宋東奎

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450052

膀胱癌是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，2015年在我國居泌尿系統(tǒng)腫瘤年發(fā)病率第一位，且呈逐年上升趨勢[1-3]。膀胱癌預(yù)后很差。如何精準(zhǔn)判斷膀胱癌預(yù)后，個體化制定診療方案，開發(fā)新的治療靶點(diǎn)，改善預(yù)后是目前研究的熱點(diǎn)。早期有絲分裂抑制因子1(early mitotic inhibitor 1，EMI1)屬于F-box蛋白家族，具有調(diào)控細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂S期的功能。EMI1過表達(dá)會導(dǎo)致單極或三極紡錘體、染色體錯誤分離、多中心體形成、胞質(zhì)分裂失敗等嚴(yán)重錯誤，進(jìn)一步導(dǎo)致雙核細(xì)胞、多倍體形成及基因組不穩(wěn)定[4-5]。已有研究[6]顯示EMI1在多種實(shí)體瘤中表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)水平與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。在乳腺癌的長期生存隨訪中發(fā)現(xiàn)，EMI1高表達(dá)的患者總體生存期縮短[7]。本研究采用免疫組化SP法檢測膀胱癌及癌旁正常膀胱組織中EMI1的表達(dá)，探討其與膀胱癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，為膀胱癌的診斷及預(yù)后判斷提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科2014年1月1日至2017年1月1日經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)或膀胱癌根治術(shù)切除的膀胱癌病理組織112例，及其配對的癌旁正常組織86例。膀胱癌患者中男69例，女43例，年齡39～82歲，所有病例均有完整的臨床及病理資料(表1)。

1.2 膀胱癌組織和癌旁正常組織中EMI1蛋白表達(dá)的檢測采用免疫組化SP法。EMI1鼠抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自英國Abcam公司。石蠟組織標(biāo)本4 μm切片，置于65 ℃烤箱中烘烤過夜。切片完全浸沒于二甲苯中5 min×4 次；梯度乙醇脫水各20 s，最后浸入蒸餾水1 min；95 ℃檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液浸泡20 min,自然冷卻至室溫；滴加新鮮配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)30 g/L的H2O2，完全覆蓋組織，室溫下避光孵育10 min；PBS沖洗3 次，去除H2O2；滴加體積分?jǐn)?shù)10%的正常羊血清封閉液，孵育20 min。EMI1一抗(用抗體稀釋液稀釋100倍)滴片，置入保濕盒內(nèi)，4 ℃過夜。HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(用PBS稀釋1 000倍)滴片，37 ℃ 20 min。DAB滴片，常溫下孵育2 min，浸水終止反應(yīng)。蘇木精染核1 min。中性樹脂封片。以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為EMI1陽性細(xì)胞。于低倍鏡(×100)下選取5個視野，高倍鏡(×400)下每個視野計數(shù)100個細(xì)胞。按陽性細(xì)胞百分比評分，0為0分，～25%為1分，～50%為2分，>50%為3分。按染色強(qiáng)度評分：淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。以上兩項評分乘積<6分為低表達(dá)，≥6分為高表達(dá)。由兩位具有3 a以上臨床經(jīng)驗的病理醫(yī)師獨(dú)立判讀，結(jié)果取平均值，差異較大的切片送第3位病理醫(yī)師判讀，舍棄偏差較大的結(jié)果后取平均值。

1.3 隨訪患者從手術(shù)日開始隨訪，隨訪方式為復(fù)診和電話隨訪。隨訪時間15～63個月，中位隨訪時間46個月，以死亡為終點(diǎn)事件。生存時間為自手術(shù)日至患者死亡時間或隨訪截止時間。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0分析，不同臨床病理特征患者EMI高表達(dá)率的比較采用χ2檢驗，86例膀胱癌與其配對癌旁正常組織中EMI1表達(dá)的比較采用配對χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制膀胱癌患者EMI1高表達(dá)組與低表達(dá)組的生存曲線，并進(jìn)行Log-rank檢驗。采用Cox回歸單因素及多因素分析膀胱癌預(yù)后的危險因素，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌及癌旁正常膀胱組織中EMI1蛋白表達(dá)的比較結(jié)果見圖1、表1。

表1 兩種組織中EMT1蛋白的表達(dá) 例

A：癌旁正常膀胱組織;B：膀胱癌組織

2.2 不同臨床病理特征膀胱癌患者EMI1表達(dá)水平的比較不同性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膀胱癌組織中EMI1高表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義,組織類型、T分期、TNM分期、病理分級差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表2 EMI1表達(dá)水平與膀胱癌患者臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.3 EMI1表達(dá)與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系EMI1高表達(dá)組和低表達(dá)組的生存曲線差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.402,P<0.001，圖2)，低表達(dá)組預(yù)后優(yōu)于高表達(dá)組。單因素分析顯示T分期、TNM分期、病理級別、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、EMI1表達(dá)水平是膀胱癌預(yù)后的影響因素。將差異有統(tǒng)計學(xué)意義的因素納入多因素Cox回歸分析結(jié)果表明遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、EMI1高表達(dá)是膀胱癌預(yù)后的危險因素(表3)。

圖2 EMI1高表達(dá)與低表達(dá)組膀胱患者生存曲線

表3 膀胱癌預(yù)后因素的Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

EMI1基因于2001年首次在非洲爪蟾提取物中被發(fā)現(xiàn)，它可通過與細(xì)胞分裂周期蛋白20結(jié)合抑制有絲分裂后期促進(jìn)復(fù)合物(anaphase promoting complex,APC)活化，積累細(xì)胞周期蛋白B，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂進(jìn)入M期[8-9]。EMI1可以抑制APC泛素化,促進(jìn)有絲分裂進(jìn)入S期；是有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，EMI1表達(dá)異常影響染色體的穩(wěn)定性及細(xì)胞正常分裂[5]。而染色體的穩(wěn)定性及細(xì)胞正常分裂是維持機(jī)體正常功能的重要前提，多倍體形成、染色體不穩(wěn)定是誘發(fā)腫瘤的重要原因，也是腫瘤的重要標(biāo)志[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，除血液腫瘤外，EMI1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、骨腫瘤中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與乳腺癌、肺癌、卵巢癌惡性程度呈正相關(guān)，與骨腫瘤臨床分期呈正相關(guān)，EMI1高表達(dá)組乳腺癌及肺癌總體生存期顯著縮短。我們的研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中EMI1表達(dá)水平升高，EMI1表達(dá)水平與腫瘤惡性程度、TNM分期等有關(guān)。既往研究[12-13]顯示膀胱癌腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、病理分級為影響腫瘤預(yù)后的因素。本研究結(jié)果表明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及EMI1表達(dá)水平是影響膀胱癌預(yù)后的因素。EMI1高表達(dá)組患者生存期縮短，提示EMI1過表達(dá)可能影響膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，對判斷膀胱癌患者的預(yù)后具有一定的指導(dǎo)意義。

膀胱癌治療是手術(shù)聯(lián)合放化療的綜合治療，本研究中EMI1高表達(dá)組患者生存期縮短可能與EMI1高表達(dá)影響膀胱癌對放化療的敏感性有關(guān)。事實(shí)上EMI1對放化療敏感性的影響較為復(fù)雜。既往研究[7,14]發(fā)現(xiàn)EMI1低表達(dá)與三陰乳腺癌合并BRCA1基因突變患者對PARPi耐藥相關(guān)，上調(diào)EMI1表達(dá)水平，三陰乳腺癌患者對PARPi治療敏感性增高。研究[15]發(fā)現(xiàn)EMI1低表達(dá)同樣與其他影響細(xì)胞周期的細(xì)胞毒藥物(順鉑及CHK1抑制劑)耐藥相關(guān)。也有研究[16]表明EMI1表達(dá)下調(diào)后多倍體細(xì)胞增多，細(xì)胞周期阻滯于S期，對阿霉素、依托泊苷敏感性升高，且DNA雙鏈斷端增多，放療敏感性增高。此外，通過siRNA下調(diào)皮膚鱗癌細(xì)胞系中EMI1表達(dá)水平，細(xì)胞存活僅為對照組的10%左右[17]。

綜上所述，EMI1在膀胱癌組織表達(dá)升高，且表達(dá)水平與膀胱癌病理分級及TNM分期有關(guān)，EMI1高表達(dá)患者預(yù)后不佳，EMI1有望成為膀胱癌患者的預(yù)后指標(biāo)及臨床治療靶點(diǎn)，相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。