王 燦，肖志鵬，向鵬華

（湖南省煙草公司衡陽市公司，湖南 衡陽 421000）

根際微生物是指在植物根系直接影響的土壤范圍內(nèi)生長繁殖的微生物，主要包括細(xì)菌、放線菌、真菌、藻類和原生動(dòng)物等，其數(shù)量一般是根際外的幾倍至幾十倍，與植物根系相互作用[1]。微生物可以將有機(jī)物分解為無機(jī)物，為植物提供有效養(yǎng)料，還能分泌維生素、生長刺激素等促進(jìn)植物生長，而根系分泌物和脫落物是微生物主要的營養(yǎng)來源和能量來源，根際的通氣條件和水分狀況可形成有利于微生物的生態(tài)環(huán)境[2]。

煙草屬忌連作的作物，根際微生物區(qū)系失衡是連作障礙發(fā)生的重要原因，會(huì)影響烤煙根際微生物群落的穩(wěn)定性，對(duì)煙株根系造成消極影響，從而對(duì)烤煙的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生不利影響[3]。肖苗苗等[4]研究了小麥玉米輪作對(duì)根際微生物多樣性的影響，結(jié)果表明玉米季的微生物豐富度高于小麥季，這說明輪作對(duì)于植株根際微生物物種組成和多樣性具有顯著影響。張子龍等[5]發(fā)現(xiàn)，輪作增加了土壤放線菌數(shù)量，略微降低了細(xì)菌數(shù)量，對(duì)真菌數(shù)量影響不大，但增加了微生物的豐富度和多樣性指數(shù)。李喆等[6]研究了不同種植模式對(duì)煙田微生物群落生態(tài)特征的影響，結(jié)果表明，相比于連作，輪作對(duì)保持烤煙根際微生物的高活性起到積極作用。根際微生物對(duì)煙草育苗、生長、病害防治和土壤改良等方面有顯著影響[7]，合理輪作/間作可以調(diào)節(jié)不同作物對(duì)營養(yǎng)元素的需求，改善煙草生長環(huán)境，有利于煙草生長。然而，目前關(guān)于煙草種植模式特別是中藥材—煙草輪作模式的根際微生物研究較為缺乏。因此，筆者采集了不同作物與煙草輪套作后的土壤樣品，通過分子生物學(xué)方法分析根際土壤中的微生物信息，探究不同輪作模式下煙草根際微生物群落組成和多樣性的差異，為開拓?zé)煵菰耘嘈履Ｊ教峁├碚撘罁?jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采集了6種作物與煙草輪套作后的土壤，分別為半夏（BG）、香菜（XG）、大蒜（DG）、蒲公英（PG）、射干（SG）、豌豆（WG），以煙草連作土壤作對(duì)照（CK）。每個(gè)小區(qū)面積130 m2，采用隨機(jī)區(qū)組排列，重復(fù)3次。煙草上部葉收獲時(shí)按照取樣要求采取根際土壤，共收集21個(gè)根際土壤樣本，置于冰袋中立即運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室于4℃以下保存，并在一周內(nèi)完成樣品預(yù)處理。

1.2 分子生物學(xué)檢測(cè)

使 用E.Z.N.A.? stool DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，USA）試劑盒提取每個(gè)樣品的DNA，所有DNA樣本在使用前均保存在-20℃冰箱中。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）測(cè)定細(xì)菌16S rRNA基因和真菌內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔（ITS）基因的豐度。每個(gè)qPCR混合物包含10 μL Premix Ex Taq?（2×）（Vazyme生物科技有限公司，南京），正向引物和反向引物各0.8 μL（5 μmol/L），1 μL模板DNA，注入滅菌去離子水至最終體積為20 μL。16S rDNA的引物序列為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）；ITS基因的引物序列為ITS 1F （5'- CTTGGTCATTTAGGAAG TAA-3'）和ITS 2R（5'-GCTGCGTTCTTTTCATCGATG C-3'）。

PCR 擴(kuò)增步驟參考李強(qiáng)等[8]的報(bào)道。擴(kuò)增結(jié)束后，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。從2%瓊脂糖凝膠中提取擴(kuò)增子，并使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒純化（Axygen Biosciences， Union City，CA， USA），然后使用QuantiFluor?-ST （Promega， USA）進(jìn)行定量分析。純化的擴(kuò)增產(chǎn)物按等分子量匯集，然后在Illumina MiSeq （Allwegene，Beijing）平臺(tái)上按照標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行配對(duì)端測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

使用PRINSEQ和 Moetur對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)過濾，修剪。以序列相似度不低于97%為原則，利用Qiime中的 Uclust工具對(duì)有效序列進(jìn)行聚類分析，根據(jù)FAPROTAX數(shù)據(jù)庫的物種注釋分類出具有生物學(xué)意義的操作分類單元OTUs（Operational taxonomi units）。利用Qiime軟件，計(jì)算每組樣品的Alpha多樣性指數(shù)。使用R-studio軟件分別繪出真菌和細(xì)菌綱水平上的群落結(jié)構(gòu)，以便進(jìn)一步分析不同處理煙草根際土壤黑脛病與青枯病致病菌的基因拷貝數(shù)。采用Canoco 5.0 軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理煙草根際土壤微生物多樣性的比較

如圖1所示，相對(duì)于CK處理，除了大蒜（DG）處理顯著降低了細(xì)菌多樣性外，其他輪作模式均顯著增加了細(xì)菌多樣性（P＜0.05）；而對(duì)于真菌，只有香菜（XG）和射干（SG）處理顯著增加了真菌多樣性（P＜0.05），其他輪作處理對(duì)真菌多樣性無顯著影響。

圖1 不同處理煙草根際土壤的細(xì)菌（A）和真菌（B）多樣性

2.2 不同處理煙草根際土壤的微生物群落多樣性

聚類分析和主坐標(biāo)分析（圖2）結(jié)果表明，同一處理的點(diǎn)位均聚集在一起，表明處理間重復(fù)性較好；而不同處理間明顯分散聚團(tuán)，表明不同處理間微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，即不同作物與烤煙輪作對(duì)煙草根際土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)組成的影響較大。其中，蒲公英（PG）和香菜（XG）處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更相似；而對(duì)于真菌，半夏（BG）、大蒜（DG）和蒲公英（PG）處理與CK聚集在一起，表明它們的根際土壤具有相似的真菌群落組成，而香菜（XG）、豌豆（WG）和射干（XG）處理的真菌群落結(jié)構(gòu)與其他4組有顯著差異（P＜0.05）。

圖2 不同處理煙草根際土壤的細(xì)菌（A）和真菌（B）群落結(jié)構(gòu)

2.3 不同處理煙草根際土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)

圖3為不同處理在綱水平上的真菌群落組成，其中香菜（XG）處理的真菌群落組成與其他組差異最大。在綱分類水平上，子囊菌門的糞殼菌綱（Sordariomycetes）為對(duì)照組根際土壤的優(yōu)勢(shì)菌種，平均相對(duì)豐度超過50%，其次為子囊菌門的座囊菌綱（Dothideomycetes），平均相對(duì)豐度約為20%；但香菜（XG）、豌豆（WG）和射干（SG）處理均顯著降低了糞殼菌綱的相對(duì)豐度（P＜0.05），而且香菜處理增加了座囊菌綱（Dothideomycetes）、傘菌綱（Agaricomycetes）以及其他豐度相對(duì)較低或分類地位未知類群的豐度，豌豆處理（WG）的被孢霉綱（Mortierellomycetes）的豐度顯著高于其他組。

圖3 不同處理煙草根際土壤真菌在綱水平上的群落組成

2.4 不同處理煙草根際土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

圖4為不同處理在綱水平上的細(xì)菌群落組成。相對(duì)于真菌群落組成，香菜（XG）處理對(duì)細(xì)菌群落組成的影響相對(duì)較小。與CK相比，香菜（XG）和蒲公英（PG）處理顯著降低了α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）和放線菌綱（Actinobacteria）的相對(duì)豐度，增加了擬桿菌綱（Bacteroidia）、Subgroup 6和Blastocatellia（Subgroup 4）的相對(duì)豐度；相反，大蒜（DG）處理則顯著降低了擬桿菌綱（Bacteroidia）的相對(duì)豐度，同時(shí)增加了放線菌綱（Actinobacteria）的相對(duì)豐度。

圖4 不同處理煙草根際土壤細(xì)菌在綱水平上群落組成變化

2.5 不同輪套作模式對(duì)植煙土壤致病微生物群落的影響

利用熒光定量PCR分析了不同模式下煙草土壤青枯菌和黑頸病致病菌豐度變化，結(jié)果如圖5所示。所有處理均顯著降低了青枯病致病菌數(shù)量，但不同輪套作模式的作用效果不同，其中豌豆輪套作和香菜輪套作的效果較好，半夏套作的效果最差。而對(duì)于黑脛病致病菌，只有蒲公英、豌豆和香菜顯著降低了其致病菌數(shù)量，其他處理對(duì)黑脛病抑制效果不顯著，半夏處理反而顯著增加了黑脛病致病菌數(shù)量。綜合比較，豌豆輪套作和香菜輪套作對(duì)抑制黑脛病和青枯病均有較好的效果。

圖5 不同處理煙草根際土壤黑脛病與青枯病致病菌的基因拷貝數(shù)

3 結(jié)論與討論

根際土壤微生物的數(shù)量和種類是影響植物生長發(fā)育和健康狀況的重要因素[8-9]，不同的根際微生物群落負(fù)責(zé)不同的生態(tài)系統(tǒng)功能[10]，根際微生物的變化直接影響土壤養(yǎng)分的吸收轉(zhuǎn)化[11]，有益微生物可提高土壤有效養(yǎng)分含量并促進(jìn)植物吸收[12]，在促進(jìn)植物生長的同時(shí)提高植物抗病能力和抗逆能力[13]。相關(guān)研究表明，不同的耕作制度會(huì)影響根際土壤微生物的多樣性及組成[14-15]，特別是有益微生物的多樣性及組成。

研究發(fā)現(xiàn)，相較于CK處理，大部分輪套作處理的根際細(xì)菌多樣性以及部分輪套作處理的真菌多樣性顯著提高，且不同輪套作處理的細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)較大差異。這說明不同輪套作處理在提高根際微生物多樣性的同時(shí)，還顯著改變了根際土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)組成，對(duì)微生物種類、數(shù)量、豐富度等均有一定影響。具體比較了不同輪套作處理煙草根際微生物在綱水平上的真菌及細(xì)菌群落組成，可以發(fā)現(xiàn)香菜、蒲公英處理對(duì)真菌和細(xì)菌群落組成影響最大，這表明煙草根際微生物對(duì)香菜、蒲公英更為敏感。試驗(yàn)結(jié)果顯示，煙草根際微生物中子囊菌門的糞殼菌綱（Sordariomycetes）、子囊菌門的座囊菌綱（Dothideomycetes）為優(yōu)勢(shì)真菌綱，α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）和擬桿菌綱（Bacteroidia）為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌綱。這些有益菌參與土壤養(yǎng)分循環(huán)，并且與土壤碳、氮等關(guān)鍵養(yǎng)分含量呈正相關(guān)，進(jìn)而促進(jìn)煙草生長發(fā)育并提高煙葉品質(zhì)。除此之外，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)輪套作處理顯著降低了青枯病和黑脛病的致病菌數(shù)量，表明試驗(yàn)所選幾種作物與煙草輪套作對(duì)黑脛病和青枯病有較好的抑制效果，值得進(jìn)一步深入研究。

總體來看，試驗(yàn)所選幾種作物與煙草輪套作對(duì)其根際土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)和豐富度有顯著影響，各處理都在不同程度上提高了土壤微生物的多樣性，但在群落結(jié)構(gòu)的組成上各不相同；不同輪作處理均顯著改變了土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)組成，香菜處理的真菌群落組成與其他組差異最大；其中豌豆輪作和香菜套種對(duì)黑脛病和青枯病具有較好的抑制效果。