陳 敏，劉博宇，阮 穎，周立平，黃 勇

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省作物表觀遺傳與發(fā)育重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.湖南省教育廳植物遺傳與分子生物學(xué)重點實驗室，湖南 長沙 410128 ；4.漢壽縣中醫(yī)院，湖南 常德 415900）

接骨草（Sambucus chinensisLindl.），又名陸英、八棱麻、走馬風(fēng)等，是忍冬科接骨木屬的高大草本或半灌木，陜西、甘肅、湖北、湖南、廣東等省區(qū)均有分布。接骨草全株都可以入藥，并且具有抗炎鎮(zhèn)痛、活血化瘀等功效[1]。接骨草中含有β-谷甾醇、胡蘿卜苷、綠原酸等多種化學(xué)成分[2]。其中綠原酸（Chlorogenic acid，CGA），又稱咖啡單寧酸，是一種苯丙素類化合物[3]，具有抗菌[4]、降血壓[5]、抗腫瘤[6]、抗氧化[7]、抗炎[8]等多種藥理作用，且有利于代謝性疾病的治療[9]，是國際公認(rèn)的“植物黃金”[10]。在醫(yī)療保健行業(yè)，綠原酸在銀黃制劑和雙黃連制劑生產(chǎn)過程中被用作質(zhì)量控制的一個重要指標(biāo)[11]。在食品行業(yè)，綠原酸廣泛用于食品和果品的保鮮[12]。在日用化工行業(yè)，日本利用綠原酸及其衍生物已經(jīng)研制出了抗衰老護(hù)膚品[13]。

近年來，很多研究者對杜仲、金銀花等植物中綠原酸的提取工藝進(jìn)行了報道，但對于接骨草中綠原酸提取工藝的報道較少。接骨草中含有較高的綠原酸含量，并且具有易于繁殖、分布廣泛等特點。為了更好地開發(fā)接骨草資源，利用接骨草中的綠原酸，該研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲波輔助提取接骨草葉中綠原酸的工藝參數(shù)，為接骨草中綠原酸的工廠化提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試接骨草栽培于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗室，采摘新鮮接骨草葉片，洗凈，置于45℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，粉碎機(jī)粉碎，過40目篩備用。

1.2 試驗方法

1.2.1接骨草中綠原酸提取的單因素試驗精確稱取接骨草粉末0.5 g，按一定液料比加入一定濃度的乙醇，超聲提取一段時間，4 000 r/min離心15 min，取0.2 mL浸提液用無水乙醇定容至10 mL，待測。分別考察液料比（mL/g）20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1，乙醇濃度60%、70%、80%、90%、100%，提取時間10、20、30、40、50 min對接骨草葉中綠原酸提取率的影響。

1.2.2接骨草中綠原酸提取的響應(yīng)面試驗通過單因素試驗確定液料比（A）、乙醇濃度（B）和提取時間（C）的水平值，以接骨草葉中綠原酸的提取率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計17組試驗，每個因素的高中低水平分別以1、0、-1 編碼，見表1。

表1 響應(yīng)面試驗的因素及水平

1.2.3綠原酸測定的波長選擇采用紫外可見近紅外分光光度計測定綠原酸含量。精密稱取5 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液，取0.1 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液0.8 mL于10 mL容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻。以無水乙醇為空白對照，在250～450 nm處進(jìn)行掃描[14]，得到最大吸收波長。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別吸取0.1 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL于10 mL容量瓶中，加無水乙醇定容，搖勻，得到濃度為0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012、0.014、0.016 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以無水乙醇為空白對照，測定其在最大吸收波長處的吸光度。以綠原酸的濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5綠原酸提取率計算精確移取0.2 mL綠原酸浸提液于10 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，搖勻，在最大吸收波長處測定其吸光值。根據(jù)公式（1）計算不同試驗組接骨草葉中綠原酸的提取率[15]。

式中：Y為綠原酸提取率（%），C為綠原酸濃度（mg/mL），V為浸提液體積（mL），n為浸提液的稀釋倍數(shù)，m為接骨草葉質(zhì)量（mg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

用紫外可見近紅外分光光度計在250～450 nm處進(jìn)行掃描，測得最大吸收波長為331 nm，如圖1所示。

圖1 綠原酸光譜圖

2.2 綠原酸測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

用綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品配置不同濃度提取的綠原酸溶液，在最大吸收波長331 nm處測定吸光度值，以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，得出綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=45.9x-0.000 3，R2=0.999 5。

圖2 綠原酸測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1液料比從圖3可以看出，液料比小于40∶1（mL/g）時，提取率隨液料比的增加而增加，但液料比大于40∶1（mL/g）后，提取率隨液料比的增加逐漸降低。這可能是因為當(dāng)液料比小于40∶1（mL/g）時，隨著提取溶劑乙醇的增加，其與接骨草葉粉末接觸更加充分，有利于綠原酸的提??；當(dāng)液料比大于40∶1（mL/g）時，隨著提取溶劑乙醇的增加，接骨草葉中其他能溶于乙醇的物質(zhì)析出，限制了綠原酸的提取。故確定40∶1（mL/g）為接骨草葉中綠原酸提取的最佳液料比。

圖3 不同液料比處理下接骨草葉中綠原酸的提取率

2.3.2乙醇濃度由圖4可知，乙醇濃度小于80%時，提取率隨乙醇濃度的增加而增加，但乙醇濃度超過80%后，提取率逐漸降低。這可能是因為乙醇濃度較低時，接骨草葉中的綠原酸不能充分溶出，隨著乙醇濃度的升高，提取率增大；但當(dāng)乙醇濃度較高時，一些其他能溶于乙醇的物質(zhì)快速溶出又限制了綠原酸的提取[16]。故確定80%為接骨草葉中綠原酸提取的最優(yōu)乙醇濃度。

圖4 不同乙醇濃度處理下接骨草葉中綠原酸的提取率

2.3.3提取時間如圖5所示，提取率隨提取時間的增加呈現(xiàn)出先增加后降低再增加的趨勢。這可能是因為提取時間過短，接骨草葉中的綠原酸不能充分提取出來，而提取時間過長，會導(dǎo)致其他雜質(zhì)的析出或者綠原酸在超聲波的作用下發(fā)生聚合，使提取率降低[17]。在試驗設(shè)定的條件下，提取10～50 min，綠原酸提取率在2.18%～2.33%之間，從節(jié)省能源和提高效率的角度考慮，后續(xù)試驗確定提取時間為20 min。

圖5 不同提取時間處理下接骨草葉中綠原酸的提取率

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

2.4.1試驗設(shè)計以接骨草綠原酸的提取率（Y）為考察指標(biāo)，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken設(shè)計響應(yīng)面試驗，使用Design-Expert（Version 8.0.6）對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。響應(yīng)面法試驗設(shè)計和結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)

2.4.2模型方程的建立及顯著性分析以提取率Y為響應(yīng)值，液料比（A）、乙醇濃度（B）、提取時間（C）為自變量，建立的二次回歸方程：Y（%）=-12.435 70+0.098 568A+0.315 52B+0.017 765C-4.525×10-4AB-2.4×10-4AC-1.15×10-4BC-6.147 5×10-4A2-1.879 75×10-3B2+7.275×10-5C2。綠原酸提取率回歸模型的顯著性檢驗見表3。

表3 回歸模型及顯著性檢驗

由表3 可知，模型的F=68.56，P＜0.000 1，說明回歸模型具有統(tǒng)計學(xué)意義。R2=0.988 8說明模型擬合性好，R2Adj=0.974 4說明可解釋97.44%相應(yīng)值的變化。失擬誤差P=0.779 3＞0.05，說明失擬項不顯著，且變異系數(shù)為0.95%，小于1%，說明試驗結(jié)果受模型外因素影響較小，可用于擬合分析[18]。液料比（A）、乙醇濃度（B）及提取時間（C）的P值均小于0.05，說明液料比（A）、乙醇濃度（B）及提取時間（C）對接骨草葉綠原酸的提取率有顯著影響。而F值越大說明影響程度越大，由此可見這3個因素對綠原酸提取率的影響表現(xiàn)為A＞B＞C，即液料比＞乙醇濃度＞提取時間。

2.4.3響應(yīng)面交互作用分析利用Design-Expert（Version 8.0.6）軟件分析，得到超聲波法提取綠原酸的3個因素之間交互作用的響應(yīng)面圖。通過曲面可以預(yù)測變量和影響值之間的相互關(guān)系，響應(yīng)面越陡峭，兩因素間的交互作用越顯著[19]。由圖6～圖8可知，液料比與乙醇濃度交互作用對綠原酸提取率影響極顯著（P＜0.01），乙醇濃度與提取時間交互作用對綠原酸提取率影響不顯著（P＞0.05），液料比與提取時間交互作用對綠原酸提取率影響不顯著（P＞0.05）。

圖6 液料比和乙醇濃度對接骨草葉綠原酸提取率影響的響應(yīng)面圖

圖7 乙醇濃度和提取時間對接骨草葉綠原酸提取率影響的響應(yīng)面圖

圖8 液料比和提取時間對接骨草葉綠原酸提取率影響的響應(yīng)面圖

2.4.4結(jié)果驗證經(jīng)Design-Expert（Version 8.0.6）分析得出，接骨草葉提取的最佳工藝為液料比45.8∶1（mL/g）、乙醇濃度77.5%、提取時間30 min，在該工藝下接骨草葉綠原酸提取率預(yù)測值為2.347 05%。對最佳工藝進(jìn)行3次驗證試驗，得到綠原酸的平均提取率為2.338 06%，與預(yù)測值相差很小，表明最佳工藝穩(wěn)定可靠。

3 討論與結(jié)論

超聲波輔助提取法可以擊碎細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的組分充分溶出。該方法成本較低，且安全無毒、污染較小，提取過后料液容易分離，提取率相對較高[20]。李愛民等[16]曾比較過乙醇浸提法、水煮法、超聲波輔助提取法和索氏提取法對接骨草葉綠原酸提取率的影響，也認(rèn)為超聲輔助提取法為接骨草葉中綠原酸提取的最佳方法。

該研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化，以接骨草葉中綠原酸提取率為響應(yīng)值，使用響應(yīng)面法共設(shè)計17組試驗。通過響應(yīng)面分析得到的最佳提取工藝參數(shù)為液料比45.8∶1（mL/g）、乙醇濃度77.5%、提取時間30 min，在此條件下接骨草葉綠原酸實際提取率為2.338 06%，與預(yù)測值相差很小，表明最佳工藝穩(wěn)定可靠，可用于接骨草葉綠原酸提取。