王 凡 蔣海靜 李成林 ＊

（1.徐州醫(yī)科大學(xué)江蘇省新藥研究與臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221004；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 徐州 221000）

0 引言

乳腺癌是中國(guó)女性中最常見(jiàn)的癌癥。 美國(guó)2020年癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示， 在確診癌癥的女性患者中，排名前三位的癌癥是乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌，共占新確診病例的50%，其中乳腺癌就占了30%。現(xiàn)有的乳腺癌治療方法包括化學(xué)治療、放射治療、靶向治療、免疫治療以及術(shù)前術(shù)后的內(nèi)分泌治療。 然而，作為一種惡性腫瘤，乳腺癌具有較高的轉(zhuǎn)移性，手術(shù)切除后極易復(fù)發(fā)，此外，用于化療的臨床藥物毒副作用較大，且腫瘤細(xì)胞極易產(chǎn)生耐藥性。 再加上早期篩查診斷方法的缺乏和高昂的治療成本，都使乳腺癌的治療困難重重。 因此，尋找有效的治療乳腺癌的方法是人類需要不斷攻克的難題，而探索高效低毒性的抗癌新藥尤為重要。

目前大部分細(xì)胞毒性抗癌藥物都是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用。 凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡的過(guò)程，機(jī)體在正常發(fā)育過(guò)程中可借助凋亡有效的清除一些無(wú)用細(xì)胞，控制細(xì)胞數(shù)量。 因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是研究抗腫瘤藥物的一個(gè)重要部分。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，天然黃酮類化合物具有抗菌、降血脂、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理作用。 然而，天然黃酮類化合物溶解度差、首過(guò)效應(yīng)明顯、生物利用度極低。 LFG-500（CHNO，見(jiàn)圖1）是利用哌嗪基和芐基取代易于發(fā)生代謝的羥基，對(duì)黃酮母環(huán)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后合成的全新化合物。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)LFG-500 具有較好的抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用， 可抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 侵襲，具有較好的抗腫瘤活性。 但是LFG-500 能否誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞凋亡尚未見(jiàn)報(bào)道。 因此，本文主要研究黃酮類新化合物L(fēng)FG-500對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，初步探討其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用及可能的機(jī)制。 相關(guān)工作可為乳腺癌的治療、LFG-500 及黃酮類化合物的抗腫瘤研究與應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖1 LFG-500（C30H32N2O5）分子結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

LFG-500 （中國(guó)藥科大學(xué)江蘇省腫瘤發(fā)生與干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）； 人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞株 （上海細(xì)胞庫(kù)）；1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）；活性氧檢測(cè)試劑盒、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液、SDSPAGE 凝膠配制試劑盒、Western 一抗稀釋液、Western二抗稀釋液 （碧云天生物技術(shù)研究所）； 胰蛋白酶、MTT、DAPI、Bovine serum albumin（美國(guó)Sigma 公司）；Annexin V/propidium iodide（PI）凋亡檢測(cè)試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（凱基生物有限公司）; BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 （美國(guó)Thermo Scientific 公司）；PARP、pro-caspase-3/cleaved-caspase-3、pro-caspase-9/cleaved-caspase-9、Bcl-2/Bax 抗體 （美國(guó)CST 公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）；恒溫CO培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)空氣技術(shù)公司）； 倒置熒光顯微鏡 （日本OLYMPUS 公司）；Tanon 垂直電泳系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；流式細(xì)胞儀（德國(guó)Miltenyi 公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7 細(xì)胞接種于含10%FBS 和1%青霉素-鏈霉素溶液的1640 培養(yǎng)基中， 于37℃、5%CO恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)傳代。

1.3 MTT 法

將MCF-7 細(xì)胞消化重懸， 按10個(gè)/孔加入96 孔板中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，給予不同濃度的LFG-500 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）培養(yǎng)4h，取出96 孔板，棄去上清并加入100 μL/孔的DMSO 以溶解沉淀物，最后使用酶標(biāo)儀于490 nm 處檢測(cè)其吸光度。 細(xì)胞活力的抑制率計(jì)算公式：

抑制率（%）=（A-A）/A×100%。

1.4 Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以0.25%胰酶-EDTA 消化，配制成10個(gè)/mL 的單細(xì)胞懸液，接種于24 孔板中，每孔接種4×10個(gè)細(xì)胞，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基替換為L(zhǎng)FG-500 濃度為10 μM、20 μM、30 μM的1640 培養(yǎng)基，作用24 h。 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，懸浮細(xì)胞200 g 離心5 min，收集；貼壁細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集。 用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，200 g 離心5 min，收集細(xì)胞。 加入500 μL 的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，混勻后加入5 μL Annexin V-FITC，混勻后加入5 μl PI，混勻。室溫、避光、反應(yīng)15 min。1h 內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞， 以0.25%胰酶-EDTA 消化， 配制成105 個(gè)/ml 的單細(xì)胞懸液， 接種于6 孔板中，每孔加入2 ml，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基替換為L(zhǎng)FG-500 濃度為10 μM、20 μM、30 μM的1640 培養(yǎng)基，作用24 h。收集懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞消化后收集，與收集的懸浮細(xì)胞合并，用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，200 g 離心5 min。 取500 μL 用去離子水稀釋的預(yù)熱至37℃的1×Incubation Buffer，加入1 μL JC-1 染料，渦旋混勻配成JC-1 工作液。 取500 μL JC-1 工作液將細(xì)胞均勻懸浮，培養(yǎng)箱中孵育20 min。 室溫離心200 g，5 min， 收集細(xì)胞，1×Incubation Buffer 洗2 次。吸取500 μL 1×Incubation Buffer 重新懸浮細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平檢測(cè)

分組及給藥同1.5。 收集懸浮細(xì)胞，并消化收集貼壁細(xì)胞， 合并。 按照1∶1000 用無(wú)血清的培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA 染料，使終濃度為10 μM。 每組加入1 mL稀釋好的DCFH-DA 染料，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。最后加入500 μL 的無(wú)血清培養(yǎng)基，吹打均勻后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 Western blot 法檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)水平

分組及給藥同1.5。 消化收集細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液充分裂解后，按BCA 蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定樣本中蛋白濃度。 同時(shí)測(cè)定樣品的光密度值，計(jì)算蛋白含量，用裂解液將各樣品調(diào)至相同濃度，加入5×上樣緩沖液混合均勻，沸水10 min，使蛋白變性。變性后的蛋白樣品于-20°C 儲(chǔ)存。樣本采用10%～15% SDS-PAGE 進(jìn)行分離， 將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，恒壓20 V，轉(zhuǎn)膜30 min。將膜用洗膜液洗滌3 次后， 轉(zhuǎn)移至含有封閉液的表面皿中，在脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h，加入對(duì)應(yīng)的一抗4℃孵育過(guò)夜。 次日用洗膜液清洗3 次后，加入對(duì)應(yīng)的二抗室溫避光孵育2 h，洗膜液清洗3 次。 隨后使用Odyssey 掃描儀掃描， 保存所得圖像用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白光密度的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，數(shù)據(jù)符合方差齊性的采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多組間比較LSD檢驗(yàn)； 若數(shù)據(jù)不符合方差齊性， 則采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。 假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)按α=0.05 判定。 *P＜0.05、**P＜0.01 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LFG-500 抑制人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞活力

采用MTT 實(shí)驗(yàn)考察不同濃度的LFG-500 對(duì)MCF-7 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。 結(jié)果顯示， 給予不同濃度的LFG-500 處理MCF-7 細(xì)胞24 h 后，LFG-500 對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用隨著濃度的升高而逐漸增強(qiáng)（見(jiàn)圖2），其IC50 值為34.07±5.81 μM。依據(jù)MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取10 μM、20 μM 和30 μM 的劑量開(kāi)展后續(xù)研究。

圖2 LFG-500 對(duì)MCF-7 細(xì)胞活力的影響

2.2 LFG-500 對(duì)MCF-7 細(xì)胞形態(tài)的影響

用不同濃度的LFG-500 處理MCF-7 細(xì)胞24 h后， 于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。 如圖3 所示，對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞輪廓清楚，細(xì)胞間結(jié)構(gòu)緊密，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛；而隨著LFG-500 劑量的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞變得分散，部分細(xì)胞變圓、漂浮。

圖3 不同濃度LFG-500 處理MCF-7 細(xì)胞24h 的細(xì)胞形態(tài)（200×）

2.3 LFG-500 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞發(fā)生凋亡

采用Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒， 利用流式細(xì)胞儀分析LFG-500 對(duì)MCF-7 細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。結(jié)果如圖4 所示，LFG-500 處理MCF-7 細(xì)胞24 h后，高劑量組凋亡率達(dá)到40.27±3.57%，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（**P＜0.01）。上述結(jié)果表明，LFG-500可誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞凋亡，繼而抑制其生長(zhǎng)。

圖4 不同濃度LFG-500 處理MCF-7 細(xì)胞24h 的細(xì)胞凋亡率

2.4 LFG-500 降低MCF-7 細(xì)胞線粒體膜電位水平

JC-1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖5 所示，與對(duì)照組相比，10 μM、20 μM 和30 μM LFG-500 組線粒體膜電位分別降 低了22.33±4.77%、28.85±6.40%、53.52±16.38%， 提示LFG-500 可能通過(guò)降低細(xì)胞線粒體膜電位，繼而激活線粒體凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖5 不同濃度LFG-500 對(duì)MCF-7 細(xì)胞線粒體膜電位的影響

2.5 LFG-500 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高

ROS 水平檢測(cè)結(jié)果如圖6 所示， 與對(duì)照組相比，LFG-500 處理MCF-7 細(xì)胞24 h， 中高劑量組細(xì)胞內(nèi)ROS 水平顯著增高，且該作用具有劑量依賴性。 上述結(jié)果提示，LFG-500 促進(jìn)MCF-7 細(xì)胞內(nèi)ROS 蓄積。

圖6 不同濃度LFG-500 對(duì)MCF-7 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

2.6 LFG-500 對(duì)MCF-7 細(xì)胞中線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白的影響

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由圖7 可以看出，與對(duì)照組相比，LFG-500 給藥組隨著劑量增大，Bcl-2 蛋白表達(dá)逐漸減少，Bax 蛋白表達(dá)逐漸增多。 同時(shí)，由圖8 可以看出， 細(xì)胞中pro-caspase-9 和pro-caspase-3 的蛋白水平顯著降低， 而cleaved caspase-9 和cleaved caspase-3 蛋白水平明顯升高， 說(shuō)明pro-caspase-9 和pro-caspase-3 分別被LFG-500 活化。 且與對(duì)照組相比，LFG-500 可顯著降低PARP 的原型表達(dá)水平。

圖7 不同濃度LFG-500 對(duì)MCF-7 細(xì)胞中Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖是惡性腫瘤的十大特征之一，而凋亡失調(diào)是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖的重要因素。 細(xì)胞凋亡又稱程序性的細(xì)胞死亡，是指細(xì)胞受到某種刺激或接收到某種信號(hào)后為了維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的由基因調(diào)控的細(xì)胞自主有序的死亡過(guò)程。 細(xì)胞凋亡具有獨(dú)特的形態(tài)特征和生化特征， 包括細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜出芽、染色質(zhì)凝聚、核仁碎裂、DNA 片段化，接著形成凋亡小體被周?chē)木奘杉?xì)胞吞噬，最后被溶酶體溶解。 腫瘤細(xì)胞凋亡在抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并闡明其可能的機(jī)制對(duì)于尋找新的抗癌藥物具有重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類新化合物L(fēng)FG-500 可顯著抑制人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞生長(zhǎng)，并呈劑量依賴性（見(jiàn)圖2）。光鏡觀察和Annexin V-FITC/PI 雙染結(jié)果都表明，LFG-500 能誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 發(fā)生凋亡 （見(jiàn)圖3、圖4），這提示LFG-500 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

細(xì)胞凋亡包括外源性死亡受體通路和內(nèi)源性線粒體凋亡通路。 在線粒體凋亡通路中，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部凋亡因子的刺激時(shí)，如癌基因激活的DNA 損傷、細(xì)胞缺氧以及細(xì)胞生長(zhǎng)因子的缺失，會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位降低， 膜通透性增加， 從而使促凋亡因子Cyt C 和AIF 釋放到細(xì)胞質(zhì)中。Cyt C 在細(xì)胞內(nèi)會(huì)結(jié)合Apaf-1（apoptotic protease activating factor-1） 形成凋亡復(fù)合物，繼而激活pro-caspase-9 以及下游的pro-caspase-3，pro-caspase-3 被激活后會(huì)分解底物，如PARP，最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。因此，本研究在明確LFG-500 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)上， 考察LFG-500 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是否與調(diào)控線粒體凋亡通路相關(guān)。 結(jié)果顯示，LFG-500 可降低線粒體膜電位（見(jiàn)圖5），可抑制procaspase-9 和pro-caspase-3 的 表 達(dá)， 促 進(jìn)cleaved caspase-9 和cleaved caspase-3 的蛋白表達(dá)，同時(shí)下調(diào)PARP 的蛋白表達(dá) （見(jiàn)圖8）。 說(shuō)明LFG-500 可刺激MCF-7 細(xì)胞，活化pro-caspase-9 和pro-caspase-3，繼而促進(jìn)PARP 切割，激活線粒體凋亡通路。

圖8 不同濃度LFG-500 對(duì)MCF-7 細(xì)胞中PARP及caspase 相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

ROS 參與多種生物學(xué)進(jìn)程，在細(xì)胞信號(hào)、生物合成過(guò)程和宿主防御方面都發(fā)揮重要作用。 在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，ROS 水平的升高和降低作為一種輕度氧化應(yīng)激反應(yīng)，參與多種致癌途徑的激活。 但是，持續(xù)的ROS 蓄積，特別是ROS 自由基的蓄積，會(huì)對(duì)DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)造成損傷，影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)。ROS 水平升高， 會(huì)刺激線粒體膜電位降低， 促使線粒體將ROS 釋放至細(xì)胞質(zhì)中，引起過(guò)度氧化應(yīng)激反應(yīng)，而這種過(guò)度氧化應(yīng)激反應(yīng)又會(huì)刺激周?chē)€粒體釋放更多的ROS，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 此外，Bcl-2 蛋白家族也參與到線粒體凋亡通路中，Bax/Bcl-2 的比例決定了細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡通路是否被激活。 通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MCF-7 細(xì)胞經(jīng)過(guò)LFG-500 處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平明顯升高（見(jiàn)圖6），同時(shí)，LFG-500 可上調(diào)促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)，即增加Bax/Bcl-2 的比值（見(jiàn)圖8）。 提示LFG-500 可能是通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS 積聚、線粒體膜電位擴(kuò)散，激活線粒體凋亡通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑制MCF-7 細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

4 結(jié)語(yǔ)

綜合以上研究結(jié)果可知， 當(dāng)MCF-7 細(xì)胞受到LFG-500 干預(yù)后，引起細(xì)胞內(nèi)ROS 水平顯著升高，過(guò)量的ROS 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞線粒體膜電位降低， 激活了線粒體凋亡通路， 最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。 本實(shí)驗(yàn)為L(zhǎng)FG-500 的抗癌作用研究提供了理論基礎(chǔ)，希望能為乳腺癌藥物治療提供新的思路。