周 偉,李俊峰,劉才周,何 強,頡曉玲

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院傳染病研究室,甘肅 蘭州 730000;2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院中心實驗室,甘肅 蘭州 730000)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19,corona virus disease 2019)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2,severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)引起的急性呼吸道傳染病,已成為國際流行的公共衛(wèi)生事件[1-2]。在我國COVID-19已被納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病,按甲類傳染病管理[3]?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案 (試行第八版)》指出,新型冠狀病毒核酸檢測靈敏度高,特異性強,是COVID-19確診和排除的重要依據(jù)[4]。眾多核酸檢測方法中實時熒光RT-PCR技術(shù)檢測SARS-CoV-2核酸片段在臨床應(yīng)用最多,技術(shù)成熟度最好[5],是目前最主要的實驗室檢查方法。

大規(guī)模人群SARS-CoV-2核酸篩檢是疫情防控的重要措施,其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與疫情防控效果密切相關(guān)。核酸檢測結(jié)果受到病程、標(biāo)本采集過程、實驗室檢測過程的質(zhì)量控制、檢測試劑等各種因素的影響[6-8]。以往對SARS-CoV-2核酸擴增試劑盒更多注重的是試劑盒冷鏈運輸及開封前冷凍保存[9]。但在大規(guī)模SARS-CoV-2核酸檢測過程中,由于標(biāo)本量激增,需要大量配制檢測試劑,不可避免地出現(xiàn)一個實驗批次沒有用完而需要將解凍融化后的試劑進行保存的情況。在實際工作中,SARS-CoV-2檢測試劑開啟后保存方式有冷凍、冷藏和室溫保存等。大部分試劑盒要求冷凍保存,但不可以反復(fù)凍融,也有建議指出短時間內(nèi)需要反復(fù)使用的試劑2～8 ℃冷藏保存更好。對于血液樣本來說,4 ℃放置不超過72 h,常溫放置不超過24 h不會影響實時熒光RT-PCR技術(shù)檢測血樣中的RNA病毒[10]。有相關(guān)研究指出,實時定量PCR試劑盒中質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品隨著凍融次數(shù)的增加穩(wěn)定性降低,因此質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品要避免反復(fù)凍融[11]。新冠疫情下大規(guī)模核酸篩檢擴增試劑不同保存方式對核酸檢測結(jié)果的影響目前未見詳細(xì)報道。

因此,研究中將SARS-CoV-2熒光定量PCR檢測試劑盒解凍融化后,采取不同保存方式(室溫保存、4 ℃冷藏保存、-20 ℃冷凍保存),在不同時間點進行核酸檢測,記錄樣本SARS-CoV-2檢測結(jié)果和SARS-CoV-2開放閱讀框1ab(ORF1ab,open reading frame 1ab)基因及核殼蛋白(N,nucleocapsid protein)基因的Ct(cycle threshold)值。從而了解擴增試劑室溫、4 ℃冷藏保存是否和冷凍保存效果一致而不影響SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果。

1 材料

1.1 研究樣本

樣本來自于試劑盒內(nèi)自帶含有SARS-CoV-2假病毒的陽性對照質(zhì)控品。試劑盒中陽性質(zhì)控品作為高濃度(1×105copies/mL)陽性樣本;2 μL陽性質(zhì)控品+398 μL陰性質(zhì)控品以1∶199稀釋200倍后作為低濃度弱陽性樣本(500 copies/mL)。高濃度和弱陽性樣本使用前震蕩混勻,瞬時離心。

1.2 試劑與儀器

擴增試劑盒為廣州達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(產(chǎn)品批號:2021277);核酸提取試劑盒為廣州達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的SARS-CoV-2核酸提取試劑盒(產(chǎn)品批號:2021154);核酸提取儀為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的Smart 32核酸提取儀;熒光定量PCR擴增儀為ABI 7500(美國Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 新冠擴增試劑處理

SARS-CoV-2熒光定量PCR檢測試劑盒在解凍融化后采取不同的保存方式(室溫保存、4 ℃冷藏保存、-20 ℃冷凍保存),在2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、72 h后分別與高濃度陽性樣本和弱陽性樣本進行了核酸擴增。每個樣本做3個平行樣,與平行樣1擴增記為試劑1,與平行樣2擴增記為試劑2,與平行樣3擴增記為試劑3,每次實驗做陰性和陽性對照。

2.2 病毒核酸提取

所有實驗均在規(guī)范化的核酸基因擴增實驗室中進行,使用達(dá)安提取試劑(產(chǎn)品批號:2021154)按照說明書的要求操作:從試劑盒中取出預(yù)分裝96深孔板,顛倒混勻后,輕甩板孔,使試劑及磁珠均集中到孔板底部,使用時小心撕去封膜,防止液體濺出;在96深孔板的第1列、第7列按順序加入200 μL樣本以及20 μL蛋白酶K;使用SMart32核酸提取儀按照預(yù)定程序進行核酸提取;第6列和第12列中的液體即為核酸溶液,可以進行實時熒光定量PCR實驗。

2.3 實時熒光定量PCR擴增

根據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增》要求,嚴(yán)格按照試劑說明書,從試劑盒中取出SARS-CoV-2 PCR反應(yīng)液A、PCR反應(yīng)液B,室溫融化后震蕩混勻,8 000 r/min離心后使用。以每管17 μL反應(yīng)液A,3 μL反應(yīng)液B配制PCR混合液,充分混勻瞬時離心后將20 μL擴增體系分裝至PCR薄壁管中。將高濃度陽性樣本、弱陽性樣本及陰陽性對照各5 μL加入薄壁管中,瞬時離心15 s后轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)檢測。ABI 7500擴增儀上FAM通道檢測N基因,VIC通道檢測ORF1ab基因,Cy5通道為內(nèi)標(biāo)基因。擴增條件為50 ℃恒溫逆轉(zhuǎn)錄2 min,95 ℃預(yù)變性及熱啟動酶激活2 min,95 ℃高溫變性5 s、60 ℃退火延伸35 s進行42個循環(huán),在后32次循環(huán)延伸時采集熒光信號。

2.4 實時熒光定量PCR擴增結(jié)果的判定

PCR擴增結(jié)束后保存實驗結(jié)果,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)基線和閾值。檢查每次實驗陰性質(zhì)控品及陽性質(zhì)控品是否同時滿足說明書中的要求,如果同時滿足則本次實驗有效,否則實驗無效,需要重新進行擴增。若FAM通道Ct值>30或無Ct值;VIC通道Ct值>30或無Ct值且Cy5通道≤30時可判樣本SARS-CoV-2 RNA陰性。若FAM通道Ct值≤30;VIC通道Ct值≤30且Cy5通道有或無擴增曲線時可判樣本SARS-CoV-2 RNA陽性。其他結(jié)果需要復(fù)查后確認(rèn)。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 高濃度陽性樣本和弱陽性樣本均檢出陽性結(jié)果

高濃度陽性樣本和弱陽性樣本在擴增試劑室溫保存、4 ℃冷藏保存、-20 ℃冷凍保存3種保存方式下,分別在2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、72 h進行實時熒光定量PCR檢測,所有樣本N基因、ORF1ab基因都出現(xiàn)了典型的S型擴增曲線,Ct值均小于30。所有樣本SARS-CoV-2 RNA核酸片段陽性。

3.2 擴增試劑保存72 h擴增曲線分析

擴增試劑3種保存方式72 h與弱陽性樣本擴增后N基因、ORF1ab基因擴增曲線分別見圖1、圖2。從圖1、圖2中可以看到9例擴增都有明顯的擴增曲線,調(diào)整基線選取合適的閾值得到弱陽性樣本與室溫保存試劑1擴增后N基因Ct值為26.11,ORF1ab基因Ct值為25.61;與室溫保存試劑2擴增后N基因Ct值為26.08,ORF1ab基因Ct值為25.49;與室溫保存試劑3擴增后N基因Ct值為26.87,ORF1ab基因Ct值為25.90。與冷藏保存試劑1擴增后N基因Ct值為26.82,ORF1ab基因Ct值為25.87;與冷藏保存試劑2擴增后N基因Ct值為26.94,ORF1ab基因Ct值為25.96;與冷藏保存試劑3擴增后N基因Ct值為26.08,ORF1ab基因Ct值為25.83。與冷凍保存試劑1擴增后N基因Ct值為26.22,ORF1ab基因Ct值為25.61;與冷凍保存試劑2擴增后N基因Ct值為25.90,ORF1ab基因Ct值為25.34;與冷凍保存試劑3擴增后N基因Ct值為25.94,ORF1ab基因Ct值為25.80。由此可以看到3種保存方式下擴增試劑與弱陽性樣本擴增反應(yīng)后9條擴增曲線基本重合,提示擴增試劑在室溫保存、4 ℃冷藏保存72 h與冷凍保存72 h效果相同。

圖1 弱陽性樣本N基因擴增曲線Fig.1 Amplification curve of N gene of weaklypositive samples

圖2 弱陽性樣本ORF1ab基因擴增曲線Fig.2 Amplification curve of ORF1ab gene ofweakly positive samples

3.3 弱陽性樣本N基因檢測結(jié)果分析

擴增試劑保存2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、72 h后弱陽性樣本N基因檢測Ct值不同,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。擴增試劑室溫保存、4 ℃冷藏保存、-20 ℃冷凍保存3種保存方式下,在每個時間節(jié)點弱陽性樣本N基因檢測Ct值不同,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示新冠核酸擴增試劑3種保存方式均不影響弱陽性標(biāo)本N基因的檢出及Ct值,擴增試劑室溫保存、4 ℃冷藏保存和冷凍保存效果一致(見表1)。

表1 弱陽性樣本N基因檢測結(jié)果(Ct值)

3.4 弱陽性樣本ORF1ab基因檢測結(jié)果分析

擴增試劑保存2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、72 h后弱陽性樣本ORF1ab基因檢測Ct值不同,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。擴增試劑室溫保存、4 ℃冷藏保存、-20 ℃冷凍保存3種保存方式下,弱陽性樣本ORF1ab基因檢測Ct值不同,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示新冠核酸擴增試劑3種保存方式均不影響弱陽性標(biāo)本ORF1ab基因的檢出及Ct值,擴增試劑室溫保存、4 ℃冷藏保存和冷凍保存效果一致(見表2)。

表2 弱陽性樣本ORF1ab基因檢測結(jié)果(Ct值)

4 討論

研究結(jié)果初步證實了SARS-CoV-2核酸擴增試劑解凍后72 h內(nèi)采用室溫保存、冷藏、冷凍3種保存方式都不會影響高濃度陽性樣本和弱陽性樣本(500 copies/mL)檢出。實驗結(jié)果表明未來可進一步優(yōu)化實驗流程,在核酸擴增實驗室2區(qū)不必單獨放置冷凍冰箱用于保存剩余核酸擴增試劑,減輕了實驗室2區(qū)放置多個冰箱的壓力。同時也避免了實驗人員誤操作帶來的生物安全風(fēng)險。因此在大規(guī)模人群篩檢時,未使用完的核酸擴增試劑只要穩(wěn)妥保存,在不受污染的情形下仍可用于后續(xù)實驗,避免了試劑浪費,在節(jié)約成本的同時提高了效率。

根據(jù)《醫(yī)療機構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊(試行 第二版)》的要求[12],新冠核酸檢測要規(guī)范開展室內(nèi)質(zhì)控,每批次至少有1份弱陽性質(zhì)控品(第三方質(zhì)控品,通常為檢出限的1.5～3倍)和3份陰性質(zhì)控品(生理鹽水),只有陰性質(zhì)控品結(jié)果為陰性,弱陽性質(zhì)控品能夠檢出陽性才視為本批次檢測在控,實驗結(jié)果可信。本次研究使用的弱陽性樣本(500 copies/mL)和試劑盒檢測下限相同,對擴增試劑差異更加敏感,檢測Ct值變化更加明顯。研究中新冠病毒核酸特異性N基因、ORF1ab基因在2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、72 h各節(jié)點的Ct值均不同,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,這可能與每批次基線和閾值的選擇及各孔實驗條件細(xì)微差別的積累有關(guān)。而不同保存方式下N基因、ORF1ab基因Ct值無統(tǒng)計學(xué)差異，提示3種保存方式在同一次擴增中無差異,說明72 h以內(nèi)擴增試劑室溫保存、4 ℃冷藏保存和冷凍保存效果一致。

COVID-19的診斷依賴于流行病學(xué)史詢問、臨床癥狀觀察及實驗室和影像學(xué)檢查結(jié)果共同確認(rèn)[13]。在眾多實驗室檢查項目中,血常規(guī)及生化指標(biāo)、凝血功能指標(biāo)、感染相關(guān)標(biāo)志物僅能提供輔助診斷信息。血清學(xué)抗原和抗體指標(biāo)是COVID-19患者確診方法之一,包括核酸檢測和病毒培養(yǎng)的病原學(xué)檢查是COVID-19患者確診的金標(biāo)準(zhǔn)[14]。由于技術(shù)難度及生物安全防護要求,能夠開展SARS-CoV-2培養(yǎng)的實驗室不多,因此SARS-CoV-2 RNA檢測是臨床實驗室最常用的檢測方法。SARS-CoV-2核酸特異性基因檢測(ORF1ab基因、N基因等)方法包括熒光定量PCR法、恒溫擴增法、雜交捕獲免疫熒光法、RNA捕獲探針法等[15]。熒光定量PCR法靈敏度高、特異性好、可選擇試劑盒種類多,是目前使用最廣泛的SARS-CoV-2核酸檢測方法。

實驗的不足之處在于:由于實驗室生物安全要求,目前很難獲得患者臨床樣本進行實驗,而是采用了模擬樣本;未對市面上其他試劑盒進行廣泛檢測,其他試劑盒是否支持本結(jié)論還需要更多樣本、更多試劑盒進一步研究。

實時熒光PCR儀器昂貴,對操作人員能力要求高,操作者需要經(jīng)過分子生物學(xué)技術(shù)專業(yè)培訓(xùn),考核合格后方能上崗。由于疫情防控需要大量人員進行新冠病毒核酸檢測工作,因此工作中應(yīng)該按照醫(yī)療機構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測工作手冊的要求選擇國家藥品監(jiān)督管理局授權(quán)的提取和擴增試劑盒,使用前要進行性能驗證及比對,同時須建立人員培訓(xùn)及考核比對程序,建立健全的生物安全防護管理制度,做好室內(nèi)質(zhì)控及室間質(zhì)評,抓好每一個實驗細(xì)節(jié)建立起全面質(zhì)量保證,確保為患者發(fā)出及時準(zhǔn)確的報告單,更好地服務(wù)于疫情防控臨床診療工作。