顧秀琰 禚君 顧萬紅

甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州730050

橢圓葉花錨（Halenia elliptica D.Don）是龍膽科花錨屬植物，以干燥地上部分入藥，味苦，性寒，具有清熱祛濕，疏肝利膽等功效［1-3］，為藏藥“蒂達(dá)”的主要基原植物收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥（第一冊(cè)）》《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》《青海省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中。蒙、彝、羌、傈僳等民族藥中也在使用。橢圓葉花錨主產(chǎn)于青藏高原，分布較廣，在藏、滇、川等省區(qū)皆產(chǎn)。2001 年被西藏紅十字會(huì)與瑞士紅十字會(huì)制定的《瀕危藏藥物種名錄》列為三級(jí)瀕危藏藥［4-5］。本實(shí)驗(yàn)通過研究橢圓葉花錨不同極性提取物，體內(nèi)外抗氧化活性，明確各有效部位活性差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 橢圓葉花錨全草（H.elliptica D.Don、H.cornpanulata）由甘肅省中醫(yī)院閔云山主任藥師，甘南林業(yè)技術(shù)服務(wù)中心杜平研究員共同鑒；DPPH（武漢艾克化學(xué)試劑公司，201503101），大鼠SOD ELISA 試劑盒（Dojindo 研究所），大鼠MDAELISA 試劑盒（Dojindo研究所）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半，SPF 級(jí)，購自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（甘）2013-0002。雌雄分籠飼養(yǎng)，每籠5 只，自由飲水和進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)室觀察7 天。

1.3 動(dòng)物模型制備 大鼠正常飼養(yǎng)7d 后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、高劑量組、低劑量組，每組20 只。除空白對(duì)照組外，其余大鼠附加高能量合劑（豬油15g、植物油15g、膽固醇7.5g、蔗糖15g、膽鹽1g、奶粉8g、復(fù)合維生素0.5g、吐溫8.5mL、丙二醇5mL，加蒸餾水至100mL），每天一次灌胃，連續(xù)30d，制備脂肪性肝炎大鼠模型。觀察到大鼠行動(dòng)遲緩、毛色晦暗、多數(shù)大鼠肝臟有不同程度的腫大或右肋下觸痛敏感、進(jìn)食量減少等體貌特征，即為模型制備成功。

1.4 方法

1.4.1 提取物的制備。取2kg 橢圓葉花錨藥材，粉碎，置于圓底燒瓶中，先后加入8 倍量和6 倍量95%乙醇溶液，分別回流提取2h 及1h，合并提取液，濾過，濾液減壓濃縮，干燥，得到粗提物425g。將所得425g 提取物，加水定容至1000mL。置分液漏斗中，分別用等倍量石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3 次，合并各萃取液，減壓干燥，分別得相應(yīng)部位提取物：石油醚部位：21g、氯仿部位82g、乙酸乙酯部位95g、正丁醇部位70g、乙醇部位68g。取各提取物適量，加95%乙醇超聲30min，制成相當(dāng)于0.1g/mL 各溶液，放置4℃條件下備用。

1.4.2 DPPH 對(duì)照液的配制。精密稱定DPPH 對(duì)照品10.0 mg，置于100mL 棕色量瓶中，95%乙醇充分溶解，定容，搖勻。即得為100μg/mL（0.2536mmol/L），DPPH對(duì)照貯備溶液，置-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。臨用前用95%乙醇稀釋10 倍即得所需濃度對(duì)照液［6-8］。

1.5 各提取物體外抗氧化活性研究

1.5.1 溶液配制?？偡磻?yīng)體積為3mL，將2mL DPPH 溶液分別加入試管中，分別取40μL、80μL、120μL、160μL、200μL 的待測溶液與一定量的95%乙醇至3mL，混勻后室溫下避光靜置30min，于517nm 處測定其吸光值A(chǔ)i［9-12］。加樣量見表1。

1.5.2 DPPH 自由基的清除能力評(píng)價(jià)方法。取2mL DPPH，1mL95%乙醇，于517nm 處測定其吸光值A(chǔ)c。取40μL、80μL、120μL、160μL、200μL 的待測溶液與一定量的95%乙醇至3000μL，于517nm 處測定其吸光值A(chǔ)j。Ai、Aj 每測一個(gè)不同量需要測3 個(gè)平行數(shù)據(jù)，而且在每測一個(gè)量的三個(gè)平行數(shù)據(jù)后都單測一次Ac。不同提取組分對(duì)DPPH 自由基清除能力（The percentage of scavenging radical capacity，SR%）的計(jì)算：SR%=［1-（Ai-Aj）/Ac］×100%。Ai-提取組、DPPH 溶液、無水乙醇的吸光度；Ac-DPPH 溶液、無水乙醇的吸光度；Aj-提取組、無水乙醇的吸光度。

表1 樣品加樣量

1.6 體內(nèi)抗氧化活性研究

1.6.1 給藥方法。造模成功七天后開始給予藥物干預(yù)。高劑量組（5g/kg）、低劑量組（1g/kg）分別將對(duì)應(yīng)劑量的橢圓葉花錨黃酮提取物，混入粉碎的飼料中，壓型烘干，飼養(yǎng)大鼠，連續(xù)15d；其余兩組大鼠正常飼養(yǎng)。

1.6.2 大鼠血清SOD、MDA 含量的測定。給藥結(jié)束后，所有大鼠再正常飼養(yǎng)7d 后，呼吸麻醉大鼠，股動(dòng)脈采血（不加抗凝劑）約5mL，以轉(zhuǎn)速3000r/min 離心10min，分離血清，按照試劑盒說明操作，檢測大鼠血清中SOD、MDA 含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)數(shù)值用Excel 軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以（±s）表示，使用Dax1.0 軟件，通過回歸方程計(jì)算半抑制率。其余數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 軟件分析，數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，選用雙因素方差分析，SOD、MDA 含量測定組間采用單因素方差分析。組間比較采SNK 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組分DPPH 清除率 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)重復(fù)3組，由待測樣品濃度和抑制率所共同形成的回歸方程得到半抑制率（IC50：當(dāng)對(duì)自由基的清除率達(dá)到50%時(shí)，待測抗氧化劑的濃度），因此清除DPPH 自由基的半數(shù)清除濃度（IC50）可以用以表示抗氧化劑清除自由基的能力。IC50 值越小，表示抗氧化劑清除自由基的能力越強(qiáng)。由各部位標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程可求得其半數(shù)抑制濃度IC50，可以看出乙酸乙酯部位具有較強(qiáng)的抗氧化活性。因此，橢圓葉花錨不同極性提取物對(duì)DPPH 自由基的清除率，在測定濃度范圍內(nèi)，均具有一定的抗氧化活性。其中乙酸乙酯提取物具有較高的抗氧化活性，石油醚部位主要是脂肪油和不飽和脂肪酸，而不飽和脂肪酸是導(dǎo)致氧化應(yīng)激的物質(zhì)之一，故抗氧化能力較弱。計(jì)算氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇提取物對(duì)DPPH 的IC50，結(jié)果分別為0.42、0.31、0.61、1.1g/L。見表2。

表2 橢圓葉花錨各組分不同濃度對(duì)DPPH 清除作用（±s，n=3）

表2 橢圓葉花錨各組分不同濃度對(duì)DPPH 清除作用（±s，n=3）

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2.2 大鼠血清SOD、MDA 含量測定 與空白組比較，模型組SOD 值減少、MDA 值升高，提示模型大鼠的過氧化反應(yīng)加速，肝細(xì)胞處于受損的變化狀態(tài)，清除氧自由基的酶系能力降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，劑量組SOD 值升高，低劑量組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），高劑量組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，高劑量組MDA 值降低，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

3 討論

清除DPPH 自由基法最早設(shè)立于上世紀(jì)末。DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，呈紫色，在517nm 有強(qiáng)吸收。加入抗氧化劑時(shí)，其中的單電子與抗氧化劑配對(duì)生成其他物質(zhì)，其顏色變淺，從而使DPPH 峰值處的吸光度變小，且吸光度的變化與DPPH 配對(duì)電子數(shù)存在定量關(guān)系，故可通過檢測最大吸收波長處的吸光度，來評(píng)價(jià)反應(yīng)自由基的清除能力。此抗氧化能力用抑制率來表示，抑制率越大，抗氧化性越強(qiáng)。清除DPPH 法的優(yōu)點(diǎn)是穩(wěn)定性好，選擇性強(qiáng)，快速，易重復(fù)，簡單，靈敏，不需要復(fù)雜的儀器，所以在生產(chǎn)活動(dòng)中大規(guī)模應(yīng)用［13］。

表3 橢圓葉花錨黃酮對(duì)SD 大鼠血清SOD 與MDA 的影響（±s）

表3 橢圓葉花錨黃酮對(duì)SD 大鼠血清SOD 與MDA 的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01

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本研究小組首先對(duì)橢圓葉花錨用不同極性的溶劑進(jìn)行提取，通過體外DPPH 法評(píng)價(jià)橢圓葉花錨不同溶劑提取物清除自由基活性能力，結(jié)果顯示石油醚提取物體基本無清除自由基能力，乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、乙醇提取物，在測定濃度范圍內(nèi)，均具有一定的抗氧化活性，且清除率與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)系。其中，橢圓葉花錨乙酸乙酯提取物具有較高的抗氧化活性，考慮石油醚部位主要是脂肪油和不飽和脂肪酸，抗氧化能力較弱。

通過進(jìn)一步對(duì)橢圓葉花錨總黃酮提取物高、低劑量組，進(jìn)行大鼠血清SOD、MDA 含量測定。研究發(fā)現(xiàn)，橢圓葉花錨總黃酮提取物，可以降低肝炎模型大鼠血清中MDA 含量、升高SOD 含量，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，與體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

近年來，對(duì)橢圓葉花錨的研究大多集中在中藥資源、化學(xué)成分、生物活性、藥效藥理及臨床應(yīng)用等方面。通過對(duì)橢圓葉花錨的高極性部位中進(jìn)行提取，分離到一些具有新母核結(jié)構(gòu)、雙葡萄糖的口山酮苷以及一些只檢測到，但至今未分離到的化合物。目前主要分離到的化合物包括：口山酮苷元、口山酮苷、香豆素類、甾醇、五環(huán)三萜類、黃酮苷元及其苷、裂環(huán)烯醚萜類、色原酮類、揮發(fā)油類等。而口山酮苷元及其苷是橢圓葉花錨中含量與種類最為豐富的化合物類型［14］。此類化合物大多極性較高，而這與乙酸乙酯提取物抗氧化活性最強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦相對(duì)應(yīng)。

對(duì)于橢圓葉花錨抗氧化作用，高潔等［14］對(duì)其全草乙醇提取物乙酸乙酯部位分離到的六個(gè)口山酮苷元進(jìn)行了抗氧化研究，發(fā)現(xiàn)其分離到的提取物，抗氧化作用十分明顯，強(qiáng)于經(jīng)典抗氧化物維生素E［15］。

另外，本課題組亦通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，橢圓葉花錨總黃酮不僅可降低肝炎模型大鼠血清MDA 含量、升高SOD 含量，且可在一定程度上改善肝細(xì)胞受損程度。橢圓葉花錨通過其有效藥物成分總黃酮作用于肝臟細(xì)胞，改善細(xì)胞功能，增強(qiáng)抗氧化酶系統(tǒng)在抗氧自由基中的作用來治療肝炎［16］。

橢圓葉花錨還具有利膽、降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)免疫功能、舒張血管、鎮(zhèn)靜、解痙、降低血壓、減慢心率的作用；而其毒性試驗(yàn)、致畸試驗(yàn)均表明花錨安全性較好，在長期給藥情況下，未表現(xiàn)出肝腎毒副作用。國外曾有報(bào)道指出倍半萜類化合物Halenin A 和Halenin B 具有一定的抗細(xì)菌和抗腫瘤活性作用［17］。由此可見，橢圓葉花錨值得進(jìn)一步深入研究。

橢圓葉花錨在某些少數(shù)民族地方志如《滇省志》或少數(shù)民族用藥記錄里都有過記載如《民族藥志一》《中國藏藥》《怒江藥》等。雖然用藥地域有差別，記載有不同的名字，但是治療范圍都很相似，主要在肝膽疾病，而且記載中都有很好的效果。橢圓葉花錨全國分布廣泛，生長環(huán)境在海拔400～4000 米。作為分布如此廣泛的植物資源，傳統(tǒng)中藥典籍里卻沒有記載，都是某些地方志或民族用藥記載，而且記載較多的地區(qū)集中在云貴川和西藏。從目前對(duì)橢圓葉花錨原植物的研究，也并沒有發(fā)現(xiàn)有其亞種或變種，可能是因?yàn)榄h(huán)境、氣候、海拔或土壤的成分造成了有效成分的差異，從而導(dǎo)致在臨床療效上出現(xiàn)重大的差異。目前國內(nèi)在橢圓葉花錨上的研究也主要集中在植物資源、有效成分、藥理及臨床應(yīng)用等方面，但迄今為止，尚未見到不同地區(qū)，不同環(huán)境，不同海拔，不同土壤下橢圓葉花錨的有效成分在含量上的差異研究。那么，在這種情況下，不僅無法進(jìn)一步精確研究其臨床療效，而且對(duì)于野生橢圓葉花錨野生馴化，人工種植也無法確定合適的地域、氣候與環(huán)境。作為中華民族民族用藥的瑰寶之一，研究橢圓葉花錨不僅要不斷完善質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而且要促進(jìn)人工野生馴化的研究，擴(kuò)大中藥來源，從而滿足中藥產(chǎn)業(yè)化開發(fā)要求。