楊文紅 丁紅煒 王魏 王林娜 郭玲

(1衡水市人民醫(yī)院皮膚科，河北 衡水 053000；2山東大學(xué)第二醫(yī)院整形外科；3衡水市人民醫(yī)院病理科)

皮膚基底細(xì)胞癌(BCC)是皮膚病理學(xué)中常見(jiàn)的非黑色素皮膚瘤，多發(fā)生于老年人，研究報(bào)道，BCC的患病率和發(fā)病率逐年不斷上升，且發(fā)病人群趨于年輕化，給患者和醫(yī)療系統(tǒng)帶來(lái)較大負(fù)擔(dān)〔1,2〕。微小RNA(miRNA)是由22個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼小分子RNA，與其靶基因結(jié)合參與調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，與細(xì)胞發(fā)育、分化、遷移等多種生物學(xué)過(guò)程相關(guān)，miRNA的異常表達(dá)與免疫應(yīng)答、神經(jīng)性疾病、癌癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔3～5〕。研究發(fā)現(xiàn)，miR-451在非小細(xì)胞肺癌中異常表達(dá)，是一種新型腫瘤抑制因子〔6〕。T結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(TBX)1是一種轉(zhuǎn)錄因子，在組織發(fā)育中起重要作用，研究顯示，miR-451可靶向作用于TBX1在BCC發(fā)生中起關(guān)鍵作用〔7〕，但關(guān)于miR-451、TBX1在BCC預(yù)后中作用的報(bào)道較少。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-451、TBX1在BCC組織中的表達(dá)，探討其與預(yù)后的相關(guān)性，以期為BCC的臨床診治提供一定理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年8月至2018年3月于衡水市人民醫(yī)院皮膚科經(jīng)手術(shù)治療的老年BCC患者85例，其中男44例，女41例，平均年齡(67.85±5.62)歲，根據(jù)其臨床表現(xiàn)分為：結(jié)節(jié)潰瘍型組38例，色素型組27例，淺表型組15例，硬斑病樣或纖維化型組5例，各組年齡、性別、體重指數(shù)(BMI)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組一般資料比較

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者年齡≥60歲；(2)組織病理學(xué)活檢確診為BCC；(3)患者的病理資料及隨訪資料完整；(4)無(wú)化學(xué)治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有免疫系統(tǒng)疾病患者；(2)患有認(rèn)知障礙和溝通障礙患者；(3)肝、腎功能不全患者。本研究獲得衡水市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，且受試者均簽訂知情同意書。

1.2主要試劑及儀器 Trizol提取試劑盒(批號(hào)：RN0401)購(gòu)自北京艾德萊生物科技公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：K1622)購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(批號(hào)：Q111-02)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；TBX1抗體(批號(hào)：PAB17338)購(gòu)自艾美捷科技有限公司；鼠抗人二抗(批號(hào)：054920)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(型號(hào)：CFX384Touch)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司；光學(xué)顯微鏡(型號(hào)：DM2700)購(gòu)自德國(guó)徠卡公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)所需引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3方法

1.3.1RT-qPCR檢測(cè)BCC患者組織標(biāo)本中miR-451、TBX1 mRNA表達(dá) 收集患者手術(shù)切取活體組織標(biāo)本，用Trizol法提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用RT-qPCR檢測(cè)BCC患者組織標(biāo)本中miR-451、TBX1 mRNA表達(dá)。miR-451上游引物：5′-AAAAAAACCGTTACCGA-3′，下游引物：5′-GTTACCATTACTGAGTT-3′；TBX1上游引物：5′-CTGACCAATAACCTGCTGGATGA-3′，下游引物：5′-GGCTGATATCTGTGCATGGAGTT-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACAGAC-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH上游引物：5′-GGAGTCCACTGGCGTCTTCA-3′，下游引物：5′-GGGGTGCTAAGCAGTTGGTG-3′。配制20 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 30 s；變性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，延伸70℃ 10 s，共35個(gè)循環(huán)。以U6、GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt計(jì)算miR-451、TBX1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2免疫組化檢測(cè)TBX1在BCC組織中表達(dá) 將患者手術(shù)切取活體組織，用10%甲醛固定做常規(guī)石蠟切片，然后進(jìn)行脫蠟水化、水浴加熱修復(fù)抗原、孵育一抗(TBX1抗體，1∶500)，4℃過(guò)夜，次日，滴加二抗，室溫孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色、水洗、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.3免疫組化結(jié)果判定 TBX1免疫組化結(jié)果判定：細(xì)胞核中出現(xiàn)黃色或棕黃色則為TBX1陽(yáng)性，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，根據(jù)Fromowitz方法〔8〕進(jìn)行評(píng)分，陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比：<5% 0分，5%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分；染色強(qiáng)度：無(wú)著色0分，淺黃色1分，黃色2分，棕黃色3分。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比得分與染色強(qiáng)度得分總和：≥2分為陽(yáng)性，<2分為陰性。

1.3.4隨訪 患者術(shù)后，前3個(gè)月每個(gè)月復(fù)查1次，4～12月每3個(gè)月復(fù)查1次，1年后主要以電話隨訪和登門拜訪兩種隨訪方式收集患者資料，隨訪截止時(shí)間2020年1月，平均隨訪(55.85±6.50)個(gè)月。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析；繪制Kaplan-Meier生存曲線，并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組BCC組織中miR-451、TBX1 mRNA表達(dá)水平 與結(jié)節(jié)潰瘍型組相比，色素型組、淺表型組、硬斑病樣或纖維化型組組織中miR-451表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，TBX1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與色素型組、淺表型組相比，硬斑病樣或纖維化型組miR-451表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，TBX1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2各組BCC組織中TBX1陽(yáng)性表達(dá) 與結(jié)節(jié)潰瘍型組〔12例(31.58%)〕相比，TBX1陽(yáng)性表達(dá)率在色素型組〔17例(62.96%)〕、淺表型組〔10例(66.67%)〕、硬斑病樣或纖維化型組〔4例(80.00%)〕BCC組織中顯著增加(P<0.05)。

2.3miR-451、TBX1表達(dá)與BCC患者臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)miR-451在BCC組織中表達(dá)水平平均值分為高表達(dá)組(≥0.91，43例)，低表達(dá)組(<0.91，42例)，miR-451、TBX1在BCC組織中的表達(dá)與患者年齡、皮損直徑無(wú)關(guān)(P>0.05)，與組織病理分型、轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組BCC組織中miR-451表達(dá)水平比較

1)與結(jié)節(jié)潰瘍型組相比，2)與硬斑病樣或纖維化型組相比:均P<0.05

表3 miR-451、TBX1表達(dá)與BCC患者臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.4BCC組織中miR-451與TBX1表達(dá)的關(guān)系 BCC組織中miR-451與TBX1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.618，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.5miR-451、TBX1在BCC組織中表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪期間72例未出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，患者無(wú)病生存率為84.71%。miR-451低表達(dá)患者無(wú)病生存率〔80.95%(34/42)〕顯著低于miR-451高表達(dá)患者〔88.37%(38/43)，P=0.044〕，TBX1陽(yáng)性表達(dá)患者無(wú)病生存率〔83.72%(36/43)〕顯著低于TBX1陰性表達(dá)患者〔85.71%(36/42)，P=0.042〕。見(jiàn)圖2。

圖1 BCC組織中miR-451與TBX1表達(dá)的關(guān)系

圖2 不同miR-451、TBX1表達(dá)BCC患者生存曲線

3 討 論

BCC多發(fā)生在面部、頭皮等曝光部位，BCC具有生長(zhǎng)緩慢、局部浸潤(rùn)性等特征，因此BCC患者發(fā)生轉(zhuǎn)移的較少，但其組織分型較多，根據(jù)其表型表現(xiàn)和組織病理學(xué)分為低風(fēng)險(xiǎn)型和高風(fēng)險(xiǎn)型，高風(fēng)險(xiǎn)型的BCC具有較強(qiáng)的浸潤(rùn)性和侵略性，在進(jìn)行手術(shù)治療后引起并發(fā)癥，即愈合缺陷，植皮失敗和傷口感染的風(fēng)險(xiǎn)較高〔9,10〕。研究表明，分子靶向治療技術(shù)在BCC臨床治療中發(fā)揮重要作用〔11,12〕，因此，在分子水平研究BCC發(fā)病機(jī)制，有利于臨床治療BCC新型靶向療法的發(fā)展和預(yù)后監(jiān)測(cè)。

miRNA可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后相關(guān)蛋白的表達(dá)并調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展，崔勝金等〔13〕研究顯示，miR-451在非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)，可以作非小細(xì)胞肺癌早期診斷的候選標(biāo)志物。高瑤等〔14〕研究顯示miR-451可以減少卵巢癌細(xì)胞增殖，是一種可以預(yù)測(cè)上皮性卵巢癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素。包佑根等〔15〕研究顯示miRNA-451在膀胱癌組織低表達(dá)，且其表達(dá)水平與膀胱癌臨床病理特征及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)，是膀胱癌潛在的調(diào)控基因。以上研究均表明，miR-451的異常表達(dá)與多種腫瘤疾病發(fā)生相關(guān)，對(duì)其診斷、預(yù)后有重要作用。本研究提示miR-451表達(dá)異常與BCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，且其表達(dá)水平可能與其病理分型有關(guān)，本研究結(jié)果提示，miR-451在BCC組織中的表達(dá)與患者組織病理分型、轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)。

TBX1屬于T-BOX家族，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)或組織發(fā)育〔16,17〕，TBX1的異常表達(dá)與遺傳性疾病、心血管疾病、腫瘤等疾病發(fā)生相關(guān)〔18～20〕，Verdelli等〔21〕研究顯示TBX1在成人甲狀旁腺細(xì)胞中表達(dá)，在甲狀旁腺腫瘤中表達(dá)失調(diào)，其中TBX1缺乏可能會(huì)導(dǎo)致甲狀旁腺腫瘤的低增殖性。本研究提示TBX1表達(dá)與BCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，進(jìn)一步研究分析發(fā)現(xiàn)，TBX1在BCC組織中的表達(dá)與患者組織病理分型、轉(zhuǎn)移情況顯著相關(guān)。Sun等〔7〕研究顯示，TBX1在BCC腫瘤組織中顯著上調(diào)，miR-451a表達(dá)水平與TBX1表達(dá)水平相反。本研究結(jié)果顯示，BCC組織中miR-451、TBX1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。徐品等〔22〕研究顯示，miR-451可以作為診斷肝癌和指示預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究進(jìn)一步Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果提示BCC組織中miR-451、TBX1表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。

綜上所述，腫瘤組織中miR-451低表達(dá)和TBX1高表達(dá)與BCC的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，可能成為BCC臨床病理分型及預(yù)后評(píng)估的輔助指標(biāo)。但由于樣本數(shù)量較少，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。