羅 靚,易天新,冷文飛

(1.重慶市中西醫(yī)結(jié)合康復(fù)醫(yī)院,重慶 400013；2.重慶市墊江縣中醫(yī)院,重慶 408300)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是臨床常見的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病,以關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)活動受限、晨僵、關(guān)節(jié)腫脹為主要臨床特點,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,通常認(rèn)為與炎癥、創(chuàng)傷、代謝、遺傳、免疫反應(yīng)等多種因素相關(guān)。目前臨床治療KOA主要通過口服抗炎止痛藥、關(guān)節(jié)腔注射藥物、康復(fù)理療、手術(shù)等方法緩解疼痛,改善功能狀態(tài),但均存在一定的局限性。而中醫(yī)藥治療KOA具有療效顯著、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢[1]。薏苡仁湯出自清·林珮琴《類證治裁》,由薏苡仁、蒼術(shù)、羌活、麻黃、桂枝、獨活、當(dāng)歸、川芎、防風(fēng)、川烏、生姜、甘草12味中藥組成,有祛風(fēng)除濕、散寒通絡(luò)止痛的功效。研究顯示,薏苡仁湯能緩解KOA患者的疼痛癥狀,改善其膝關(guān)節(jié)功能,且安全性較好[2]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,將薏苡仁湯的活性化學(xué)成分及關(guān)鍵作用靶點篩選后進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建“中藥復(fù)方-成分-靶點-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò),探討其治療KOA的有效藥物成分和可能作用機(jī)制,為新藥的研發(fā)和臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 薏苡仁湯有效活性成分篩選 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php),分別以薏苡仁湯所含的12味中藥作為Herb name,設(shè)置口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選條件檢索有效活性成分[3]。

1.2 有效活性成分靶點預(yù)測 采用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索有效活性成分的靶點蛋白名稱,并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)轉(zhuǎn)換為基因名。

1.3 KOA疾病相關(guān)靶點信息收集 將“knee osteoarthritis”作為關(guān)鍵詞分別輸入DisGeNET(http://www.disgenet.org/search)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中,檢索KOA疾病靶點,分別設(shè)置Score≥0.3和Score≥10,刪除重復(fù)基因。

1.4 疾病與藥物共同靶點和核心活性成分篩選 運用Venny 2.1.0平臺(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對薏苡仁湯有效活性成分靶點與KOA疾病相關(guān)靶點進(jìn)行映射,獲得共同靶點。將共同靶點和對應(yīng)的中藥活性成分輸入Cytoscape 3.7.1進(jìn)行關(guān)聯(lián),根據(jù)中介中心性(BC)對活性成分進(jìn)行降序排列,篩選出核心活性成分。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)繪制 將藥物與疾病的交集靶點基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)中,設(shè)置置信度≥0.4和“homo sapiens(人屬)”為關(guān)鍵詞,繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖,根據(jù)分析結(jié)果統(tǒng)計靶標(biāo)蛋白關(guān)聯(lián)頻次。

1.6 基因富集分析 通過R軟件Cluster Profile程序包(http://bioconductor.org/bioc Lite.R)對篩選出的共同基因進(jìn)行GO功能、KEGG通路富集分析后繪制柱狀圖、氣泡圖進(jìn)行可視化處理。

1.7 中藥復(fù)方-成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)薏苡仁湯、有效活性成分、靶點、通路與KOA之間的關(guān)系,建立中藥復(fù)方-成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)。采用Cytoscape 3.7.1進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

(1)薏苡仁湯的有效活性成分篩選 收集薏苡仁湯12味中藥中不同活性成分共168種,其中薏苡仁9種,蒼術(shù)9種,羌活15種,獨活9種,防風(fēng)18種,川烏3種,麻黃23種,桂枝7種,當(dāng)歸2種,川芎7種,生姜5種,甘草92種。不同藥物中含有共同的活性成分,這些成分在發(fā)揮作用時可能起到增效作用。見表1。

表1 薏苡仁湯的有效活性成分

續(xù)表

(2)藥物靶點與疾病靶點的交集預(yù)測和核心活性成分篩選 利用Uniprot、TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出有效活性成分不同的藥物靶點212個,通過DisGeNET、GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到KOA疾病靶點198個,導(dǎo)入Venny 2.1.0進(jìn)行映射后獲得交集靶點28個。藥物-疾病的交集靶點可認(rèn)為是薏苡仁湯干預(yù)KOA的潛在基因靶點,見表2。將28個基因靶點與其對應(yīng)的中藥活性成分進(jìn)行關(guān)聯(lián),根據(jù)BC對活性成分進(jìn)行降序排列,篩選出主要核心活性成分為谷甾醇、甘露醇、漢黃芩素、柚皮素、花旗松素、槲皮素。

表2 薏苡仁湯干預(yù)膝骨關(guān)節(jié)炎的潛在基因靶點

(3)PPI網(wǎng)絡(luò)圖 將28個交集靶點導(dǎo)入STRING平臺,設(shè)置置信度≥0.4和“homo sapiens(人屬)”為關(guān)鍵詞,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖1見正文第125頁)?；赟TRING平臺構(gòu)建共獲得28個節(jié)點,296條邊,平均Degree為21.2,其中節(jié)點表示靶標(biāo)蛋白,每條邊表示靶標(biāo)蛋白之間的作用關(guān)系。按點度中心性值降序排列后對核心作用靶點進(jìn)行篩選,得到的核心靶點前10位為白細(xì)胞介素-6(IL-6)、趨化因子配體2(CCL2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、白細(xì)胞介素-1B(IL-1B)、基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(PTGS2)、纖連蛋白1(FN1)、趨化因子配體8(CXCL8)。

圖1 薏苡仁湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎28個交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

(4)GO功能和KEGG通路富集分析 通過R軟件和Cluster Profile程序包,以P＜0.05為篩選條件,對薏苡仁湯治療KOA的潛在靶點進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。①GO功能富集分析:A.生物過程1 162個,主要涉及細(xì)胞外基質(zhì)組織形成、細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織形成、神經(jīng)炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)、炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)、白細(xì)胞遷移、急性期反應(yīng)、細(xì)胞間黏附正調(diào)節(jié)等(圖2見正文第125頁)。B.細(xì)胞組分8個,包括細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、纖維狀膠原三聚體、帶狀膠原纖維、膠原三聚體、膠原三聚體復(fù)合物、細(xì)胞外基質(zhì)成分、血小板α顆粒內(nèi)腔(圖3見正文第125頁)。C.分子功能30個,包括細(xì)胞因子活性、受體配體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、生長因子受體結(jié)合、整聯(lián)蛋白結(jié)合、生長因子活性、金屬內(nèi)肽酶活性、細(xì)胞黏附分子結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)組成等(圖4見正文第125頁)。②KEGG通路富集分析71條,取排名前20位進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)由高到低依次為糖基化終產(chǎn)物及其受體信號通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、IL-17信號通路、阿米巴病、流體剪切應(yīng)力、動脈粥樣硬化等,用高級氣泡圖列舉排名前20位的條目,氣泡大小表示富集的通路條數(shù),顏色表示P值大小(圖5見正文第125頁)。

圖2 薏苡仁湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎GO功能生物過程分析

圖3 薏苡仁湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎GO功能細(xì)胞組分分析

圖4 薏苡仁湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎GO功能分子功能分析

圖5 薏苡仁湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎KEGG通路富集高級氣泡圖

(5)構(gòu)建中藥復(fù)方-成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò) 根據(jù)中藥復(fù)方、成分、靶點、通路、疾病之間的關(guān)系,通過Cytoscape 3.7.1進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化。在導(dǎo)出的網(wǎng)絡(luò)圖(圖6見正文第125頁)中,用不同顏色節(jié)點表示活性成分、靶點、通路等,黃色菱形節(jié)點表示薏苡仁湯,紅色菱形節(jié)點表示KEGG和KOA,粉紅色圓形節(jié)點表示核心活性成分,藍(lán)色正方形節(jié)點代表核心作用靶點,綠色六邊形節(jié)點代表作用信號通路,各節(jié)點之間構(gòu)成關(guān)系通過邊連接。圖中顯示同一靶點對應(yīng)多個作用通路和多個作用靶點對應(yīng)同一通路的關(guān)系。

圖6 薏苡仁湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎中藥復(fù)方-成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

近年來KOA的發(fā)病率不斷上升,但其病因尚不完全明確,可能與多種細(xì)胞因子調(diào)控和多基因表達(dá)有關(guān)[4]。KOA屬于中醫(yī)“痹證”范疇,《黃帝內(nèi)經(jīng)》言:“病在骨者,骨重不可舉,骨髓酸痛,寒氣至,名曰骨痹?！惫屎疂裥凸潜杂捎谒伢w外感風(fēng)寒濕邪,內(nèi)外之邪痹阻經(jīng)脈所致。薏苡仁湯有祛風(fēng)除濕、散寒通絡(luò)止痛的功效,其中薏苡仁、蒼術(shù)健脾除濕,桂枝、川烏、麻黃溫經(jīng)散寒兼除濕,川芎、當(dāng)歸養(yǎng)血活血,防風(fēng)、獨活、羌活祛風(fēng)勝濕,生姜溫中散寒,甘草調(diào)和諸藥。有研究表明,薏苡仁具有調(diào)節(jié)免疫功能、調(diào)整代謝紊亂的作用[5-6],麻黃具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用[7],防風(fēng)可抗骨質(zhì)疏松[8],獨活、當(dāng)歸均可抗炎及保護(hù)軟骨[9-10],羌活、川烏可抗炎鎮(zhèn)痛[11-12],蒼術(shù)、桂枝、川芎、生姜均有抗炎作用[13-16]。雖然現(xiàn)代研究對薏苡仁湯中各主要成分的藥理作用研究較多,但對其治療KOA的作用機(jī)制報道較少。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,對薏苡仁湯治療KOA的作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究,發(fā)現(xiàn)薏苡仁湯治療KOA的核心成分為谷甾醇、甘露醇、漢黃芩素、柚皮素、花旗松素、槲皮素。有研究表明,血清膽固醇是骨關(guān)節(jié)炎(OA)進(jìn)展的危險因素,在OA早期可觀察到軟骨內(nèi)脂質(zhì)沉積[17],谷甾醇有降低血清膽固醇的作用,從而延緩OA進(jìn)程。漢黃芩素是一種類黃酮,通過抑制氧化應(yīng)激、軟骨細(xì)胞凋亡,增加軟骨生成標(biāo)記物的表達(dá),抑制炎癥介質(zhì)表達(dá)以治療OA[18]。有研究借助薄層色譜法驗證了槲皮素與IL-6蛋白對接良好,對KOA發(fā)揮鎮(zhèn)痛和抗炎作用[19]。然而,目前對于甘露醇、柚皮素、花旗松素治療KOA的機(jī)制研究較少,尚需進(jìn)一步研究驗證。

通過分析PPI網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn),薏苡仁湯治療KOA的核心蛋白包 括 IL-6、CCL2、MMP-9、VEGFA、MMP-2等。IL-6是一種促炎細(xì)胞因子,對于慢性炎性反應(yīng)有重要意義,滑膜成纖維細(xì)胞分泌IL-6后,促炎性mRNA表達(dá)增加[20]。CCL2是一種高特異性趨化因子,機(jī)械刺激間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)CCL2募集經(jīng)典單核細(xì)胞,這些細(xì)胞可以分化為吸收骨的破骨細(xì)胞,其遺傳消融或?qū)ζ浼?xì)胞表面趨化因子受體2(CCR2)的藥理靶向作用減輕了機(jī)械誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎惡化[21]。VEGFA屬于血小板衍生生長因子(PDGF)/VEGF生長因子家族,在關(guān)節(jié)炎癥進(jìn)展中參與了誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞遷移、抑制凋亡等過程,而其剪接軸的變化與關(guān)節(jié)炎癥相關(guān)[22]。MMP-2和MMP-9同屬于明膠酶類,MMP-2在不同類型的關(guān)節(jié)炎中可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解,某些促炎細(xì)胞因子的釋放也通過MMP-2激活來調(diào)節(jié),導(dǎo)致進(jìn)一步的組織破壞[23]。MMP-9多與關(guān)節(jié)軟骨所受壓應(yīng)力所致關(guān)節(jié)軟骨Ⅳ型膠原纖維降解有關(guān)[24]。

GO富集分析結(jié)果顯示,薏苡仁湯治療KOA與細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織形成、神經(jīng)炎性反應(yīng)等生物合成與代謝過程有關(guān)。有研究表明,軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解之間平衡狀態(tài)的維持是OA發(fā)生與否的關(guān)鍵因素[25]。細(xì)胞組分涉及細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、纖維狀膠原三聚體等,這些成分可能參與了細(xì)胞增殖與凋亡、炎性反應(yīng)等過程。分子功能涵蓋細(xì)胞因子活性、受體配體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、生長因子受體結(jié)合、整聯(lián)蛋白結(jié)合等。薏苡仁湯治療KOA的KEGG信號通路多與調(diào)節(jié)免疫和抗炎有關(guān),主要有糖基化終產(chǎn)物及其受體信號通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、IL-17信號通路等,而糖基化終產(chǎn)物及其受體信號通路多與糖尿病相關(guān)疾病有關(guān),作用于KOA的報道較少,或可成為新的探索思路。

綜上所述,薏苡仁湯可通過多成分、多靶點、多途徑發(fā)揮對KOA的治療作用,為后續(xù)的藥物研發(fā)和臨床治療提供了新的方向。

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