張艷輝 吳江華 孫保存②

腫瘤靶向治療及免疫治療極大地促進了精準治療的發(fā)展。腫瘤個體化治療有賴于精確的腫瘤伴隨診斷（companion diagnostic，CD）。伴隨診斷能夠為腫瘤患者提供針對治療藥物療效反應的信息。在臨床治療決策之前，往往需要對特定腫瘤組織生物標記物進行檢測，進而篩選獲益患者，制定個體化治療方案[1]。傳統(tǒng)的腫瘤病理診斷模式依賴于診斷醫(yī)師的經(jīng)驗，不可避免具有一定的主觀性。隨著數(shù)字化掃描切片在臨床病理中的應用，人工智能（artificial intelligence，AI）輔助診斷的計算機技術在腫瘤組織圖像分析中快速發(fā)展。本文概述AI在腫瘤病理中的應用進展，并闡述近年來AI在臨床診療密切相關的組織病理分子標志物定量分析領域的探索及應用，從而為腫瘤智能診療模式的發(fā)展提供有益的參考。

1 數(shù)字病理與深度學習

全病理切片數(shù)字掃描是一種現(xiàn)代數(shù)字系統(tǒng)與傳統(tǒng)光學顯微放大裝置有機結合的技術，其通過全自動顯微鏡掃描采集獲得高分辨率的數(shù)字圖像，并應用計算機量化組織切片掃描圖像的形狀、大小和顏色等信息，從而得到虛擬的全切片數(shù)字圖像（whole slide image，WSI）。數(shù)字掃描技術推動傳統(tǒng)病理圖像的數(shù)據(jù)收集和觀察模式發(fā)生變化，數(shù)字病理（digital pathology，DP）的概念由此產生。DP系統(tǒng)目前已廣泛應用于臨床診斷、遠程會診及數(shù)據(jù)分析等病理學領域[2]。不僅如此，DP圖像包含大量的像素級數(shù)字信息，從而為使用計算機工具輔助分析腫瘤組織的形態(tài)特征提供了應用基礎。

在過去的幾十年里，圖像處理領域的AI算法已從傳統(tǒng)的機器學習（machine learning，ML）逐漸發(fā)展為深度學習（deep learning，DL）。DL是ML的一個重要的分支，起源于人工神經(jīng)網(wǎng)絡的研究，通過堆疊層結構形成一個深度前饋神經(jīng)網(wǎng)絡，從而將低層特征組合成更加抽象的高層特征[3]。相比其他ML算法，DL對圖像數(shù)據(jù)的特征提取能力更強。其中，深度卷積神經(jīng)網(wǎng)絡是組織病理圖像計算機識別中常用的網(wǎng)絡結構之一，能夠將掃描獲取的數(shù)字化病理圖像進行特征提取及分析，從而將腫瘤病理診斷與計算機技術有機結合，進行目標檢測、分類診斷和定量分析等病理診斷任務的輸出（圖1）。目前，DL在腫瘤分類、細胞檢測、突變預測及預后分析等方面取得了顯著的進展，從而為臨床腫瘤病理提供了新的診斷模式[4]。

2 AI在腫瘤組織標志物定量分析中的應用

免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色作為檢測腫瘤蛋白表達水平的最常用技術方法，常用于確定腫瘤的分類、預后分級、藥物治療的靶點及預測藥物治療的反應等，從而為臨床的診療策略提供組織病理學的篩選依據(jù)[1]。在臨床開展治療之前，檢測一些腫瘤分子病理標記物的表達狀態(tài)已成為必要條件。目前AI應用研究相對較多且具有代表性的腫瘤組織分子指標，如人表皮生長因子受體-2（Her-2）、細胞增殖相關抗原（Ki-67）及細胞程序性死亡配體-1（PD-L1）的圖像分析。

2.1 Her-2

在乳腺癌中，評估Her-2蛋白表達和基因擴增狀態(tài)對乳腺癌的臨床用藥至關重要。指南推薦采用IHC法檢測Her-2蛋白的表達水平或應用熒光原位雜交技術（FISH）檢測Her-2基因的擴增水平，兩種檢測方式相互補充。Her-2在IHC染色切片上通常表現(xiàn)為膜著色，病理醫(yī)師通過觀察腫瘤細胞的陽性比例及著色強度，對Her-2進行綜合評分以指導靶向治療。然而，實踐研究表明這種Her-2的人工評分具有主觀性，容易出現(xiàn)診斷醫(yī)生之間的差異。

AI技術在Her-2判讀分析中的應用較早，目前有不少應用于乳腺癌Her-2檢測的數(shù)字分析軟件平臺。Tuominen等[5]提供了一個Her-2在IHC分析軟件-ImmunoMembrane。該研究采用顏色反卷積分離細胞膜陽性，根據(jù)膜染色強度和完整性生成定量評分。Brugmann等[6]開發(fā)了HER2-CONNECTTM軟件用于乳腺癌Her-2的數(shù)字圖像分析，基于評估細胞膜連續(xù)性的算法以評估Her-2的IHC染色結果，在訓練集上的總體一致性為92.1%，在驗證集上的總體一致性為92.3%。Saha等[7]提出了一種基于DL的Her2Net，能夠對Her-2染色進行自動化評估，該模型實現(xiàn)了高準確率和僅6.84%的假陽性率。2016年舉辦的Path-Soc大會上，針對Her-2評分系統(tǒng)進行了算法之間及計算機與病理專家之間的“人機比對”競賽。參與競賽的算法模型通過對86例乳腺癌Her-2的數(shù)字掃描圖像進行分析進而評估表達結果，與病理專家具有高度的可比性[8]。

Her-2在腫瘤細胞中可染色成完整的膜陽性或僅部分膜陽性。針對Her-2染色異質性的特點，Tewary等[9]使用校正的白平衡對輸入圖像進行預處理，并使用CMYK和RGB色彩空間提取蘇木素和腫瘤細胞膜上的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色。對于每個染色通道進行分割和后處理生成掩模。隨后使用骨骼化和形態(tài)學方法對掩模按照完整或不完整膜染色進行計數(shù)。此外，在Her-2熒光圖像分析中，Hofener等[10]提出了一種基于密度的方法來量化FISH信號，用于計算和確定Her-2與CEP17信號的比率，從而輸出Her-2熒光染色判讀結果。該研究表明，AI不僅能夠應用于IHC圖像，也可應用于熒光染色數(shù)字圖像的自動化分析。

計算機輔助診斷在Her-2染色評分算法的應用表明了AI對分子病理指標進行精確定量評分方面的巨大潛力。Yue等[11]的多中心應用測試表明，使用基于細胞級分類的Her-2評分算法和顯微鏡實時增強現(xiàn)實系統(tǒng)，可以顯著提高病理醫(yī)生對Her-2評估的準確性和可靠性。Vandenberghe等[12]的研究顯示，AI輔助診斷可以通過識別誤診風險高的病例以及顯著減少人工評分主觀性帶來的偏差，進而輔助乳腺癌的臨床診療。除乳腺癌外，Her-2也廣泛使用于胃癌等腫瘤靶向治療獲益患者的篩選，但目前在其他癌種中AI判讀Her-2的研究鮮見報道。

2.2 Ki-67

Ki-67作為腫瘤增殖指數(shù)的指標，常應用于評估腫瘤的生長活性及腫瘤分級。在胃腸道神經(jīng)內分泌腫瘤（neuroendocrine neoplasm，NEN）中，Ki-67的定量讀數(shù)作為分級標準，對后續(xù)腫瘤的治療及預后預測起著關鍵的指導作用[13]。臨床實踐通過人工讀數(shù)Ki-67陽性的腫瘤細胞比例進行腫瘤的分級，但可重復性并不理想。

目前，針對Ki-67的IHC檢測結果判讀方法，包括顯微鏡下視覺評估、人工手動計數(shù)、采集圖像半自動判讀以及數(shù)字圖像全自動判讀。在NEN中的Ki-67數(shù)字圖像與人工對比研究的結果表明，計算機輔助診斷效果要優(yōu)于單純的顯微鏡下人工視覺判讀[14]。在乳腺癌中，Voros等[15]通過數(shù)字化計數(shù)方法評估乳腺癌活檢數(shù)字圖像上的Ki-67指數(shù)，然后在相同圖像上疊加網(wǎng)格進行計數(shù)，結果顯示通過數(shù)字圖像計數(shù)可顯著提高Ki-67 指數(shù)分析的可重復性。國內有研究應用Nuclear 9.0軟件對細胞核的Ki-67染色進行分析，發(fā)現(xiàn)計算機輔助閱片與人工閱片一致性較好且具有省時、客觀性好、易質控、重復性好等優(yōu)勢[16]。

通過計算機輔助圖像定量分析Ki-67可用于預后相關研究。Dirican等[17]使用ML方法對Ki-67評分及預后因素進行聚類分析，表明Ki-67評分是一種與乳腺癌預后及其對新輔助化療反應相關的實體腫瘤增殖標志物。Wang等[18]采用人工常規(guī)方法和計算機輔助圖像分析方法計算159例肺神經(jīng)內分泌腫瘤手術標本Ki-67增殖指數(shù)，揭示區(qū)分低級別與高級別肺神經(jīng)內分泌腫瘤的Ki-67指數(shù)臨界值，用于預后預測。

由于Ki-67在腫瘤細胞及淋巴細胞、間質細胞等非腫瘤細胞中均可顯示陽性。因此，計算機識別Ki-67陽性細胞類別的準確性和陽性標記自動計數(shù)是全自動判讀的關鍵步驟。Niazi等[19]采用遷移學習方法，通過在Ki-67染色切片圖像中識別腫瘤邊界，對Ki-67指數(shù)的自動判讀具有較高的敏感性和特異性。Valkonen等[20]利用細胞角蛋白（cytokeratin，CK）-Ki-67雙重染色切片作為訓練圖像，開發(fā)了一種基于深度學習的數(shù)字掩模，用于自動檢測和區(qū)分上皮細胞，具有良好的效果。計算機輔助Ki-67指數(shù)判讀顯示了定量分析結果和可重復性好等優(yōu)勢，但實現(xiàn)全自動分析，需要建立在良好的腫瘤細胞識別模型的基礎上。

2.3 PD-L1

近年來，基于免疫檢查點抑制劑的免疫治療為腫瘤精準治療帶來了新的突破。IHC檢測PD-L1的表達作為預測標志物已在國內外許多醫(yī)院病理科中開展。染色結果通過病理醫(yī)師半定量判讀方式進行評估，以指導腫瘤患者免疫治療獲益人群篩選。由于PD-L1可在腫瘤細胞及多種免疫細胞中表達，陽性表達模式復雜，因此對PD-L1染色結果的判讀具有較大的挑戰(zhàn)性。多項實踐研究表明，臨床病理醫(yī)師對PD-L1判讀的一致性和可重復性均不足[21-22]。同時，人工估算的方式常無法獲取精確的PD-L1表達數(shù)值，在治療過程中可能存在療效的異質性差異，上述問題給目前臨床免疫治療帶來了新的挑戰(zhàn)。

相對于病理醫(yī)生在光學顯微鏡下的視覺判讀，有多項研究嘗試建立一種基于數(shù)字切片和AI技術定量評估 PD-L1 表達評分的方法（表1）。Koelzer等[23]使用隨機森林樹的監(jiān)督學習方法，在黑色素瘤的PD-L1染色數(shù)字圖像中定量分析腫瘤細胞的PD-L1評分，其結果與病理醫(yī)生在顯微鏡下對PD-L1的評分具有高度一致性（r=0.97，P＜0.000 1），同時數(shù)字圖像分析能夠降低PD-L1人工分析的差異。Kapil等[24]使用生成對抗網(wǎng)絡的半監(jiān)督方法通過整合人工標注以及多位病理專家評測結果構建定量評估PD-L1腫瘤細胞表達評分的模型，對270例晚期非小細胞肺癌針吸活檢標本進行PD-L1表達的自動化評分，結果顯示該模型與人工評分具有良好的一致性。Taylor等[25]使用帶反饋回路的監(jiān)督學習在230例非小細胞肺癌中構建了腫瘤細胞和免疫細胞評分的模型，該模型在腫瘤細胞/免疫細胞評分與病理專家的評測結果方面一致性良好。腫瘤細胞評分：Lin's相關系數(shù)0.68～0.81；免疫細胞評分：Lin's相關系數(shù)0.53～0.88。Wu等[26]通過基于U-ResNet結構的全卷積神經(jīng)網(wǎng)絡模型進行腫瘤細胞分割，建立良好的腫瘤細胞自動識別模型并進行膜陽性評估和計算，從而輸出具體腫瘤細胞陽性比例評分（TPS）數(shù)值。該結果在PD-L1抗體22c3和SP263測試集中，AI系統(tǒng)的TPS評分結果與受培訓病理醫(yī)生之間具有良好一致性（22c3：r=0.942 9～0.945 8；SP263：r=0.978 7）。同時，AI輔助診斷測試顯示，在AI系統(tǒng)的輔助下未培訓普通病理醫(yī)生的組內一致性和診斷效率顯著提高。

表1 PD-L1評分AI判讀模型的相關研究

上述研究表明，DP分析及利用ML方法可以精準地獲取PD-L1的染色評分，同時在可重復性和診斷效率方面顯示出了優(yōu)勢，這或許是克服免疫治療時代免疫病理指標判讀困難的有力工具[27]。

3 AI在腫瘤組織標志物診斷中的優(yōu)勢及挑戰(zhàn)

隨著腫瘤組織染色技術和DP的快速發(fā)展，AI在處理高通量、多維度圖像信息方面的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)，為腫瘤診治帶來新的機遇[28-29]。腫瘤伴隨診斷標志物與治療決策緊密相關，臨床實踐對這些標志物的判讀標準通常較為嚴格，判讀醫(yī)生通常需要多次培訓。盡管人為制定了一系列人工判讀的閾值標準，然而傳統(tǒng)診斷模式仍依賴于診斷醫(yī)師的經(jīng)驗，不可避免具有一定的主觀性。同時，組織標志物的判讀通常比較耗時費力，極大地增加了腫瘤診斷負荷，也對診斷醫(yī)師提出了較高的挑戰(zhàn)。AI輔助的腫瘤病理診斷具有自動化、效率高和可重復性高等特點，尤其對組織病理標志物能夠實現(xiàn)定量化判讀，進而提升腫瘤伴隨診斷的客觀性及精確性[30]。同時，AI圖像分析結果在不同醫(yī)院和檢測中心更容易共享和重復，進而協(xié)助診斷醫(yī)師在病理指標檢測和判讀方面進行標準化的制定，并減輕日常診斷負荷。因臨床精準治療的迫切需求，對組織標志物的AI輔助定量分析可能是臨床執(zhí)行應用的一個重要方面，很可能在不久的將來成為臨床診斷輔助工具中的一部分。

AI在組織病理標記物定量分析領域實現(xiàn)臨床應用，仍然需要解決許多問題，如模型構建過程中標注的數(shù)據(jù)量、腫瘤染色和掃描圖像數(shù)據(jù)的質量控制、細胞精確分割等。DL有多種學習模式，通常包括監(jiān)督學習、無監(jiān)督學習和半監(jiān)督學習等。目前，通過病理醫(yī)生的人工標注進行有監(jiān)督的ML是比較常用的方法，但這種方法需要大量高質量的專業(yè)注釋圖像，研究實踐中有一定的困難。一些ML模式如主動學習和弱監(jiān)督學習算法在減少病理圖像數(shù)據(jù)對人工標注的需求方面同樣取得了較大的進展[31-32]。

由于DL算法模型具有“黑盒子”性質及臨床疾病的復雜性，計算機模型系統(tǒng)目前仍不能完全代替實際臨床實踐[33]。大部分現(xiàn)有AI模型僅限于小樣本集的訓練和測試。盡管這些模型在有限的數(shù)據(jù)集顯示出與專家評估良好的一致性，但臨床實踐中，這些AI算法和診斷系統(tǒng)是否可行，仍有待真實世界的臨床觀察。針對臨床應用級圖像開發(fā)的計算機模型需要確切的臨床流程進行驗證[34]。

4 結語與展望

腫瘤病理標志物評估的準確性及客觀性對于腫瘤診斷及臨床治療決策至關重要。目前基于DL的AI技術與數(shù)字病理相結合，可使診療相關的腫瘤組織生物標記物的評估更具重復性和可靠性。將組織標記物染色切片掃描構成與精準治療緊密相關的DP圖像集合，并構建相應的AI判讀系統(tǒng)，將是構建腫瘤智能精準診療體系的重要方向。計算機專家、腫瘤醫(yī)生和病理醫(yī)生需要緊密協(xié)作，根據(jù)臨床診療的具體需求開發(fā)更有針對性的腫瘤分子病理標志物的模型算法，運用大樣本病例數(shù)據(jù)驗證并制定相應的臨床質控流程，從而實現(xiàn)腫瘤組織標記物的智能伴隨診斷模式。