◎ 張丹鶴,周瑩瑩,劉定舟,朱欣欣,崔倩倩,賈松濤,趙林萍
(1.河南中標檢測服務有限公司,河南 鄭州 450001;2.鄭州中道生物技術有限公司,河南 鄭州 450001)
喹諾酮類,又稱吡酮酸類,是一類合成抗菌藥。因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強、組織穿透力強、價格低廉以及與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等特點,被廣泛應用于畜禽多種疾病的預防和治療[1]。恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星是家禽養(yǎng)殖中的常用藥,使用率較高[2]。但是,如果在畜禽養(yǎng)殖過程中不合理用藥,或者未嚴格按照休藥期用藥,易導致畜禽產品的藥物殘留超標,對人類健康帶來安全隱患。在農產品質量安全監(jiān)管中,不確定度顯得極為重要,尤其是當檢測結果處于限量附近時,通過方法的不確定度的評估,可以對檢測結果的準確性進行評價,以驗證樣品是否合格[3]。本研究對實驗室應用《食品安全國家標準 動物性食品中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留的測定 液相色譜-串聯質譜法》(GB 31658.17—2021)測定雞肉中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星含量進行了不確定度分析,找出影響結果的主要分量,在實際操作中對這些分量進行重點控制,有利于在獸藥殘留檢測工作中對檢測結果作出更準確的判定。
Thermo Fisher TSQ Quantis/Vanquish超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀(美國賽默飛世爾科技公司);20~200 μL移液槍,100~1 000 μL移液槍(Dragon);0.000 01 g感量分析天平(美國奧豪斯Ohaus);0.01 g感量分析天平(上海佑科儀器儀表有限公司);50 mL容量瓶。
標準物質:恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星,均由Dr. Ehrenstorfer GmbH生產;甲醇、乙腈、甲酸,均為色譜純,由Thermo Fisher公司生產;其他試劑均為分析純;實驗用水為一級水。
標準儲備液配制:用十萬分之一天平稱量5 mg的標準物質,用0.03 mol·L-1氫氧化鈉溶液溶解并定容至50 mL,配制成濃度為100 μg·mL-1的標準溶液。
1 μg·mL-1混合標準工作液的配制:分別用移液器取0.1 mL濃度為100 μg·mL-1的標準儲備液,于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。
0.1 μg·mL-1混合標準工作液的配制:用移液器取1 mL濃度為1 μg·mL-1的混合標準工作液,于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。
提取凈化:稱取試樣1 g(準確至±0.01 g),按照GB 31658.17—2021的測定步驟進行處理,收集洗脫液,45 ℃水浴氮氣吹干。加入復溶液1.0 mL,渦旋1 min溶解殘余物,14 000 r·min-1離心5 min,過0.22 μm濾膜后,供液相色譜-串聯質譜儀測定[4]。
精密量取混合標準工作溶液適量,分別加入7份經提取和凈化的空白試樣殘渣中,45 ℃水浴氮氣吹干,加入復溶液1.0 mL渦旋溶解殘余物,配制成濃度為 2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、 50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的基質匹配系列混合標準溶液,0.22 μm濾膜過濾。
將配制的基質匹配標準曲線和樣品溶液,用超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀進行測定。以基質匹配標準溶液濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標,繪制標準工作曲線,求回歸方程和相關系數,用外標法計算試樣中藥物的殘留量。計算公式如下:
式中:C為測定樣液中被測組分的濃度,ng·mL-1;V為定容體積,mL;m為樣品重量,g;X為樣品中待測組分的含量,μg·kg-1;f為稀釋倍數。
根據上述結果計算公式,在實驗過程中f為1,是一個常數,因此不確定度評定中此參數可忽略不計。由于實驗過程步驟多,包括提取和凈化等多個步驟,很難對各環(huán)節(jié)進行評定,具有不可控性,可通過加標回收率等對處理樣品過程中的不確定度進行評定。綜合得到雞肉中3種喹諾酮類藥物(恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星)的質量分數計算的不確定度評定數學模型如下:
式中:X為試樣中藥物殘留量的數值,μg·kg-1;C為樣品溶液中被測組分的濃度,μg·mL-1;m為樣品重量,g;V為試樣中最終定容體積的數值,mL;Rrec為回收率校正因子。
根據實驗過程及數學模型分析,3種喹諾酮類藥物(恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星)殘留測定的不確定度主要來源于樣品稱量、樣品溶液中被測組分的濃度、最終定容體積和樣品前處理過程(通過加標回收率來反映)等。被測組分的濃度受標準儲備液、標準曲線配制、校準曲線擬合等的影響較大。下面以恩諾沙星為例計算測量不確定度,然后以同樣方法計算環(huán)丙沙星、沙拉沙星的測量不確定度。
本實驗中稱量樣品1.00 g,所用天平精密度為0.01 g。校準證書給出的擴展不確定度U1=0.01 g,k=2。標準不確定度=0.01/2=0.005 g,相對不確定度urel(m)=0.005/1=0.005。
主要由標準物質的純度、標準物質稱量和標準儲備液定容過程引入。
2.3.1 標準物質純度引入的相對標準不確定度urel(p)
3種喹諾酮類標準物質的純度、不確定度和包含因子見表1。標準物質證書給出的是擴展不確定度,屬于正態(tài)分布,置信概率P=95%,包含因子k=2,是B類評定,標準物質引入的相對標準不確定度為:
根據上述計算公式,求得環(huán)丙沙星的相對不確定度為0.007 10,沙拉沙星的相對標準不確定度為0.010 30。
表1 3種標準物質的來源、純度及擴展不確定度表
2.3.2 標準物質稱量引入的相對標準不確定度
標準儲備液配制時,恩諾沙星稱取5.01 mg,環(huán)丙沙星稱取5.42 mg,沙拉沙星稱取5.15 mg。十萬分之一天平校準證書給出的擴展不確定度U2=0.05 mg,k=2,是B類評定。以恩諾沙星為例,標準不確定度,相對標準不確定度。
根據上述計算公式可得,環(huán)丙沙星標準物質稱量時引入的相對標準不確定度為0.004 61,沙拉沙星標準物質稱量時引入的相對標準不確定度為0.004 85。
2.3.3 標準儲備液定容引入的相對標準不確定度
根據《標準玻璃量器檢定規(guī)程》(JJG 20—2001)[5], 50 mL A級容量瓶的允許誤差為±0.016 mL, 容量瓶引入的不確定度為B類不確定度,符合矩形分布,包含因子,標準不確定度,容量瓶體積引入的相對標準不確定度。
儲備液配制過程中所用的溶劑為0.03 mol·L-1氫氧化鈉水溶液,水的體積膨脹系數為2.1×10-4℃-1[6]。 容量瓶在20 ℃校準,實驗室溫度范圍為(20±3)℃,水的溫差效應引起的體積變化為50 mL×3 ℃×2.1× 10-4℃-1=0.031 5 mL,溫度導致體積變化符合矩形分布,溫度對體積影響引入的標準不確定度0.018 2,相對標準不確定度=0.000 364。
2.3.4 計算合成相對標準不確定度
以恩諾沙星為例,標準儲備液配制過程引入的相對標準不確定度:
經計算,環(huán)丙沙星標準儲備液配制引入的不確定度為0.008 48,沙拉沙星標準儲備液配制引入的不確定度為0.011 40。
2.4.1 移液器使用引入的不確定度
根據《移液器檢定規(guī)程》(JJG 646—2006)[7],用200 μL移液器移取200 μL的允許誤差是±3.0 μL,移取100 μL的允許誤差是±2.0 μL,移取20 μL的允許誤差是±0.8 μL。因標準中未規(guī)定50 μL的允許誤差,移取50 μL的允許誤差取最大容量允許誤差±4%計算,為±2.0 μL。
以200 μL移液器吸取100 μL溶液為例計算移液器引入的不確定度,允許誤差是±2.0 μL,取均勻分布,標準不確定度,引入的相對不確定度urel(vy1)=1.15/100=0.011 5,由此計算方法得到200 μL移液器移取其他體積的不確定度urel(vx),見表2。
表2 200 μL移液器引入不確定度表
2.4.2 混合標準工作液配制過程引入的不確定度
(1)1 μg·mL-1混合標準工作液配制過程中引入的不確定度。10 mL A級容量瓶的允許誤差為±0.006 mL,容量瓶引入的不確定度為B類不確定度,符合矩形分布,包含因子,標準不確定度,容量瓶體積引入的相對標準不確定度。標準工作液配制過程中所用的溶劑為甲醇,甲醇的膨脹系數為1.1×10-3℃-1。容量瓶在20 ℃校準,實驗室溫度范圍為(20±3)℃,甲醇的溫差效應引起的體積變化為10 mL×3 ℃×1.1×10-3℃-1=0.033 mL,溫度導致體積變化符合矩形分布,溫度對體積影響引入的標準不確定度,相對標準不確定度。根據表2,200 μL移液器吸取100 μL標準儲備液引入的不確定度為0.011 5, 則1 μg·mL-1混合標準工作液配制過程中引入的不確定度為:
(2)0.1 μg·mL-1混合標準工作液配制過程中引入的不確定度。根據《移液器檢定規(guī)程》(JJG 646—2006)[7],用1 000 μL移液器移取1 000 μL的允許誤差是±10 μL,相對不確定度=0.005 77。參照1 μg·mL-1混合標準工作液不確定度評定分析過程,經計算得到0.1 μg·mL-1混合標準工作液配制過程中引入的相對標準不確定度為urel(b2)=0.006 09。
2.4.3 標準曲線溶液配制的不確定度urel(L)
標準曲線各濃度點配制的不確定度由所用混合標準工作液、移液器吸取一定體積的標準工作液以及用移液器吸取1 mL定容引入。吸取標準溶液時移液槍的使用過程見表3。以100 ng·mL-1濃度點的配制過程為例,相對不確定度:
按照此分析方法,經計算得200 ng·mL-1、50 ng·mL-1、20 ng·mL-1、10 ng·mL-1、5 ng·mL-1和2 ng·mL-1的不確定度分別為0.015 7、0.026 5、0.012 1、0.014 2、0.024 6 和0.024 6,計算時取標準曲線溶液的最大不確定度 值0.026 5。
表3 標準曲線配制過程表
2.4.4 線性擬合引入的不確定度
將標準溶液分別注入液相色譜串聯質譜儀進行測定,進樣量為5 μL,得到恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星標準曲線線性回歸相關系數R2分別為0.999 6、0.999 3、0.999 9,因此線性擬合引起的不確定度可以不做考慮。
提取過程中,氮氣吹干后,最后用1 mL移液槍吸取1 mL復溶液復溶。用1 000 μL移液器移取1 000 μL 的允許誤差是±10 μL,按矩形分布計算,量取1 mL復溶液的相對標準不確定度為:
樣品前處理過程的不確定度通過添加樣的回收率和精密度進行評定,屬于A類評定[8]。取雞肉空白基質,加入適量混合標準溶液,得到含量為20 μg·kg-1(與測試樣品濃度相當)的空白加標雞肉樣品,每個濃度6個平行,按照實驗方法進行處理。6次測定的回收率、回收率的標準偏差見表4。恩諾沙星的相對標準不確定度。經計算可得環(huán)丙沙星和沙拉沙星的相對標準不確定度分別為0.020 7、0.029 1。
表4 添加樣回收率及其標準偏差表
合成相對標準不確定度計算公式為:
各檢測項目的相對標準不確定度結果見表5。
表5 各檢測項目合成相對標準不確定度表
報告中雞肉中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星測定結果X測分別為20.40 μg·kg-1、17.80 μg·kg-1、18.90 μg·kg-1。
u(X)=urel(X)×X,取包含因子k=2,擴展不確定度U=k×u(X),k=2,測定結果為X=X±U,k=2,具體結果見表6。
表6 各項目最終結果表
分析各不確定度分量的評定數據可以得出,在實驗室按照《食品安全國家標準 動物性食品中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留的測定 液相色譜-串聯質譜法》(GB 31658.17—2021)測定雞肉中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星含量時,影響不確定度的主要環(huán)節(jié)是標準儲備液配制、標準曲線和回收率。在日常檢測工作中,需要重視這些環(huán)節(jié),使用高純度標準物質,保證標準溶液的準確度,盡量將回收率控制在較高水平。在標準溶液配制過程中,相較容量瓶,使用移液器引入的不確定度較大。因此,實驗室要定期對移液器進行校準,必須要正確操作、定期維護,保證移液器的準確。