王芝燕，劉輝，李均艷，劉永利，孫慧珠

(1.常州市武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，常州 213161；2.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院，石家莊 050227)

咳喘合劑是常州市武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院兒科特色制劑，是由麻黃(炙)、苦杏仁、蟬蛻、葶藶子、地龍、白前、甘草、金蕎麥、魚腥草、川芎、法半夏、浙貝母12味中藥提取加工制成的合劑，具有止咳、祛痰、平喘的功效，用于咳嗽、支氣管哮喘、肺炎等兒科呼吸道常見病癥，在臨床使用中療效顯著[1]。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS/MS)技術(shù)具有專屬性強、快速靈敏等特點，廣泛用于中藥多成分同時定性定量分析[2-4]，為更全面控制藥品質(zhì)量，建立同時檢測多個藥味中多種特征成分[5-7]已成趨勢。在前期的研究中，以高效液相色譜(HPLC)法測定了咳喘合劑中的蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、槲皮素4種成分含量，但存在耗時長、樣品處理步驟多等缺陷，本文建立了UPLC/MS/MS法同時監(jiān)測咳喘合劑中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿，苦杏仁苷，阿魏酸，貝母素甲、貝母素乙特征成分，旨在建立便捷可靠的測定方法，為咳喘合劑的全面質(zhì)量控制提供科學(xué)方法和依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 6500超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國AB Sciex公司)；XPE26型電子天平(美國Mettler Toledo公司，感量：0.001 mg)，XS105型電子天平(美國Mettler Toledo公司，感量：0.01 mg)；Integral10超純水儀(美國Millipore公司)； KQ-5000DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)

1.2試藥 對照品：鹽酸麻黃堿(批號：171241-201809，含量：99.8%)；鹽酸偽麻黃堿(批號：171237-201510，含量：99.9%)，苦杏仁苷(批號：110820-201607，含量：90.7%)，阿魏酸(批號：110773-201915，含量：99.4%)，貝母素甲(批號：110750-201612，含量：96.2%)、貝母素乙(批號：110751-201712，含量：97.7%)，甘草苷(批號：111610-201908，含量：95.0%)，甘草次酸(批號：110723-201715，含量：99.6%)。對照品均購自中國食品藥品檢定研究院?？却蟿?批準(zhǔn)文號：蘇藥制字Z04000267)樣品10批，由常州市武進(jìn)中醫(yī)醫(yī)院生產(chǎn)(批號：200418，200407，200311，200225，200117，191207，190907，190719，190318，181223)。甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨均為色譜純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1混合對照品溶液制備 取各對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每毫升含鹽酸麻黃堿0.3 μg、鹽酸偽麻黃堿0.8 μg、苦杏仁苷6.5 μg、阿魏酸0.5 μg、甘草苷1.5 μg、貝母素甲0.15 μg、貝母素乙0.1 μg、甘草次酸0.05 μg的混合溶液，即得。

2.2供試品溶液制備 取樣品搖勻，精密量取2 mL，置50 mL量瓶中，加入適量70%乙醇，密塞，超聲處理20 min，取出，放冷，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3陰性樣品溶液制備 按處方比例及工藝分別制備缺麻黃、苦杏仁、川芎、甘草及法半夏、浙貝母的陰性樣品，并按“2.2”項下方法制備溶液，即得。

2.4色譜及質(zhì)譜條件 色譜條件：色譜柱為菲羅門 Kinetex C18柱(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；以甲醇為流動相A，0.1%甲酸為流動相B，梯度洗脫程序見表1；柱溫：40 ℃，流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：1 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序 Tab.1 Gradient elution procedures

質(zhì)譜條件如下，離子源：ESI，掃描方式：正負(fù)離子掃描，監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)，脫溶劑氣溫度：500 ℃，質(zhì)譜參數(shù)詳見表2。

表2 定性和定量離子及質(zhì)譜條件 Tab.2 MS parameters for each constituent

2.5專屬性考察 分別取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按“2.4”項下進(jìn)樣分析，結(jié)果樣品色譜中與對照品色譜相同保留時間處出現(xiàn)色譜峰，而陰性樣品相應(yīng)位置無相應(yīng)峰，不干擾測定。結(jié)果見圖1，方法專屬性良好。

圖1 對照品、樣品、陰性樣品定量離子對色譜圖 Fig.1 Chromatograms of reference standards，sample and negative sample

2.6線性關(guān)系及靈敏度考察 以“2.1”項下對照品濃度為中心，配制系列濃度混合對照品溶液，分別注入超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，按“2.4”項下進(jìn)行測定，以進(jìn)樣濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，各待測成分線性關(guān)系良好。取混合對照品溶液，逐級稀釋并進(jìn)樣測定，以儀器的信噪比S/N為3時計算檢測限(LOD)。結(jié)果見表3。

表3 各待測成分線性關(guān)系考察結(jié)果 Tab.3 Linear relationship of each constituent

2.7精密度實驗 取“2.1”項下混合對照品溶液，在“2.4”測定條件下進(jìn)樣測定6次，測得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、阿魏酸、甘草苷、貝母素甲、貝母素乙、甘草次酸峰面積RSD分別為1.9%，2.5%，2.3%，1.5%，1.6%，0.8%，1.5%，1.4%，表明儀器精密度良好。

2.8重復(fù)性試驗 分別精密量取咳喘合劑樣品(批號：200418)2 mL，共6份，照正文方法制備供試品溶液，含量測定結(jié)果見表4，各待測成分RSD范圍為1.1%～4.1%，方法重復(fù)性良好。

表4 8種代表性成分重復(fù)性試驗結(jié)果 Tab.4 Results of repeatability test of 8 representative components μg·mL-1

2.9穩(wěn)定性實驗 取“2.8”項下供試品溶液1份，于 0，4，8，12，15，24 h 在 “2.4”項測定條件下進(jìn)樣測定，測得鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、阿魏酸、甘草苷、貝母素甲、貝母素乙、甘草次酸峰面積RSD分別為1.3%，2.7%，2.6%，2.5%，1.9%，3.2%，1.5%，2.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10回收率實驗 采用加樣回收法，取“2.7”項下已知含量的樣品1.0 mL，共6份，精密稱定，置50 mL量瓶中，分別精密加入適量濃度的混合對照品溶液1 mL，按正文方法制備供試品溶液。按“2.4”項下條件測定，計算回收率。結(jié)果見表5，平均回收率在101.1%～106.6%范圍內(nèi)，RSD為2.2%～4.1%，各待測成分方法準(zhǔn)確性良好。

表5 8種代表性成分回收率實驗結(jié)果 Tab.5 Results of recovery test of 8 representative components

續(xù)表5 8種代表性成分回收率實驗結(jié)果 Tab.5 Results of recovery test of 8 representative components

2.11樣品測定結(jié)果分析 取10批咳喘合劑樣品，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別計算各待測成分的含量，10批樣品測定結(jié)果見表6，不同批次樣品測定結(jié)果偏差小，樣品均一性良好。

表6 樣品中8種代表性成分測定結(jié)果 Tab.6 Content determination results of of 8 representative components in samples μg·mL-1

10批樣品中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、苦杏仁苷、阿魏酸、甘草苷、貝母素甲、貝母素乙、甘草次酸的平均含量分別為10.704，33.034，146.783，12.086，40.518，3.670，2.082，1.608 μg·mL-1。

3 討論

3.1分析方法的選擇 本方中含12味藥材，其中所含成分種類較多，采用HPLC-UV法測定時進(jìn)行檢測的色譜峰干擾較多，不能同時滿足定性定量的需求。UPLC/MS/MS法可準(zhǔn)確、快速，具有在高靈敏度的前提下保證高分辨率(高精度)的優(yōu)點[8]，可以在16 min內(nèi)同時完成8種成分的定量測定和定性分析。

3.2色譜質(zhì)譜條件優(yōu)化 8種待測成分性質(zhì)各異，分別采用正、負(fù)離子檢測模式進(jìn)行了比較，結(jié)果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、貝母素甲、貝母素乙4種生物堿類其[M+H]+峰響應(yīng)較高，采用正離子模式檢測；苦杏仁苷、阿魏酸、甘草苷及甘草次酸4種成分的[M-H]-峰響應(yīng)值較高，因此采用負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。為增強待測成分離子化，以0.1%甲酸溶液為水相，選定的各待測物的母離子和子離子響應(yīng)良好。

3.3提取溶劑考察 取供試品適量，分別以50%甲醇、70%甲醇、甲醇、50%乙醇、70%乙醇溶液為提取溶劑，制備供試品溶液，按擬定條件測定。結(jié)果表明以70%乙醇為提取溶劑，可以將樣品全部溶解，所測得各待測成分含量較高，因此選擇70%乙醇作為提取溶劑。

多組分含量測定能更好地反映中成藥的整體質(zhì)量，本研究中的測定方法可以同時測定咳喘合劑中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、阿魏酸、苦杏仁苷、貝母素甲、貝母素乙、甘草苷、甘草次酸等8種特征成分的含量，具體操作簡單且專屬性強，為進(jìn)一步評價咳喘合劑質(zhì)量提供了參考。