蔡曉翠，丁曼，李俊，陳菊，賀金華

(1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004；2.新疆銀朵蘭藥業(yè)股份有限公司，烏魯木齊 830000)

比那甫西顆粒，由天山堇菜、玫瑰花、盒果藤、甘草浸膏、司卡摩尼亞脂、阿里紅六味藥組成。處方是根據(jù)現(xiàn)代中醫(yī)藥理論及維吾爾醫(yī)理論組成的復(fù)方制劑，在和田地區(qū)和喀什地區(qū)的醫(yī)院臨床使用已有20多年，具有清除體內(nèi)異常體液質(zhì)、清腦、止頭痛、化痰止咳的功效，多用于治療熱性感冒[1]。比那甫西顆粒針對(duì)熱性(干熱、濕熱)感冒1487例療效觀察，總有效率為85%。近年的臨床結(jié)果統(tǒng)計(jì)，比那甫西顆粒70%用于熱性感冒，30%用于其他適應(yīng)證引起的發(fā)熱、咳嗽等病癥，具有顯著良好的臨床效果，并已取得醫(yī)療機(jī)構(gòu)院內(nèi)制劑的批準(zhǔn)文號(hào)。

目前，比那甫西顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有薄層鑒別項(xiàng)，無含量測(cè)定項(xiàng)，不夠全面科學(xué)，不同批次制劑的質(zhì)量難以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)，質(zhì)量不穩(wěn)定和不均一，缺乏有效的質(zhì)量控制手段。因此，本研究對(duì)制劑進(jìn)一步深入研究，首次以處方中主要藥材特征性成分為基礎(chǔ)，建立比那甫西顆粒的對(duì)照指紋圖譜；以制劑中君藥天山堇菜和玫瑰花的主要成分和處方比例較高甘草浸膏的主要成分為指標(biāo)，建立了秦皮乙素、沒食子酸和甘草酸銨的含量測(cè)定方法，提升了制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為該品種生產(chǎn)過程及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；CPA-225D電子天平(Sartorius公司，感量：0.01 mg)；安捷倫TC C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；AS-10250BDT型超聲清洗儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2材料 比那甫西顆粒，編號(hào)S1～S12，批號(hào)分別為：Y170521、Y170641、20190308、20190315、20190307-1、20190307-2、20190316、Y190501、Y190502、Y170638、Y170642、Y180921，新疆銀朵蘭藥業(yè)股份有限公司。沒食子酸(批號(hào)：110831-201605，含量90.8%)、秦皮乙素(批號(hào)：110741-201708，含量99.9%)、甘草酸銨(批號(hào)：110731-201619，含量93%)以上對(duì)照品，均購于中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸、秦皮乙素、甘草酸銨對(duì)照品適量，加50%甲醇溶液制成每毫升分別含2.47，3.75，5.80 mg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇溶液至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備 精密稱定本品1.0 g，置燒瓶中，加50%甲醇溶液20 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取45 min，放冷，用50%甲醇溶液補(bǔ)重，搖勻，取上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3陰性樣品溶液的制備 按比那甫西顆粒處方工藝，分別制備不含天山堇菜、玫瑰花和甘草浸膏的陰性樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.2色譜條件 Agilent TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.05%磷酸溶液為B，按表1中規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長272 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序 Tab.1 Mobile phase gradient elution procedure

2.3方法學(xué)考察

2.3.1精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)的混合對(duì)照品溶液，依“2.2”項(xiàng)測(cè)定，以甘草酸銨峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.0%，相對(duì)峰面積RSD<4.5%。表明該儀器精密度良好。

2.3.2穩(wěn)定性試驗(yàn) 取比那甫西顆粒(批號(hào)：Y170521)1.0 g，依“2.1.2”項(xiàng)處理，在10 ℃下放置 0，2，4，8，12，24 h時(shí)，依“2.2”項(xiàng)測(cè)定，以甘草酸銨峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.0%，相對(duì)峰面積RSD<4.5%。表明供試品溶液在10 ℃放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3重復(fù)性試驗(yàn) 取比那甫西顆粒(批號(hào)Y170521)6份，各1.0 g，按“2.1.2”項(xiàng)處理，依 “2.2”項(xiàng)測(cè)定，記錄峰面積，以甘草酸銨峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.0%，相對(duì)峰面積RSD<5.0%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.4特征圖譜的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.4.1特征圖譜的建立及共有峰的標(biāo)定 取12批比那甫西顆粒樣品(S1～S12)，依“2.1.2”項(xiàng)處理，依“2.2”項(xiàng)測(cè)定，記錄色譜圖，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)(2012版)” 軟件進(jìn)行色譜峰匹配，樣品S1的色譜圖設(shè)為參照?qǐng)D譜，經(jīng)多點(diǎn)校正和峰匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜，共標(biāo)定21個(gè)共有峰。結(jié)果見圖1。

S1～S12.12批比那甫西顆粒；R.對(duì)照。圖1 12批比那甫西顆粒的指紋圖譜 S1-S12.twelve batches of binafuxi granules；R.Reference.Fig.1 Fingerprints of 12 batches of binafuxi granules

2.4.2色譜峰歸屬分析 分別取S1樣品、玫瑰花藥材、天山堇菜藥材、甘草浸膏、缺玫瑰花陰性樣品、缺天山堇菜陰性樣品和缺甘草浸膏陰性樣品，依“2.1.2”項(xiàng)制備供試品溶液，依“2.2”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，21個(gè)共有峰中，1，5，12號(hào)峰來自玫瑰花，2，4，21號(hào)峰來自天山堇菜，3，7，9，10，11，15，16，17，18，19，20號(hào)峰來自甘草浸膏，6號(hào)峰來自玫瑰花、天山堇菜和甘草浸膏，8號(hào)峰來自玫瑰花和甘草浸膏，13號(hào)峰來自司卡摩尼亞脂，14號(hào)峰來自甘草浸膏和盒果藤。通過比對(duì)各個(gè)峰的保留時(shí)間、紫外吸收光譜，確定各個(gè)峰的歸屬。其中1，4，5，9，18號(hào)峰分別為沒食子酸、秦皮乙素、綠原酸、甘草苷、甘草酸銨。其中甘草酸銨峰的峰面積最大、含量最高，故選用18號(hào)峰作為參照峰(S)。

A.供試品；B.天山堇菜藥材；C.玫瑰花藥材；D.甘草浸膏藥材；E.不含天山堇菜陰性樣品；F.不含玫瑰花陰性樣品；G.不含甘草浸膏陰性樣品。圖2 供試品、藥材與陰性樣品色譜圖 A.sample；B.viola tianshanica maxim；C.rose；D.licorice extract；E.negative sample without viola tianshanica maxim；F.negative sample without rose；G.negative sample without licorice extract.Fig.2 HPLC chromatograms of sample，herband negative samples

2.4.3相似度評(píng)價(jià) 將12批樣品的HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果12批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.9，具有相似性，表明比那甫西顆粒的生產(chǎn)工藝穩(wěn)定。

2.4.4聚類分析 采用SPSS21.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)12批次比那甫西顆粒指紋圖譜的21個(gè)共有峰相對(duì)峰面積進(jìn)行聚類分析，采用組間聯(lián)結(jié)法，度量標(biāo)準(zhǔn)為歐式平方距離，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，S3，S5，S8，S9，S12為一類，S1，S2，S10，S11為一類，S4，S7，S6單獨(dú)為一類，說明不同產(chǎn)地、不同時(shí)期的藥材對(duì)制劑的質(zhì)量有一定的影響。

圖3 12批比那甫西顆粒聚類分析結(jié)果 Fig.3 Cluster analysis result of 12 batches of binafuxi granules

2.4.5主成分分析 將12批樣品的21個(gè)共有峰相對(duì)峰面積導(dǎo)入SIMICA-P11.5版軟件進(jìn)行主成分分析，前3個(gè)成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為81.005%，表明前3個(gè)主成分能夠包含比那甫西顆粒色譜的主要信息。主成分分析得分圖見圖4，其中主成分1主要來自2，7，8，14，15，主成分2主要來自3，10，16，17，18，21，主成分3主要來4，5，6，21，結(jié)果表明，S1，S2，S10，S11為一大類，S3，S4，S5，S6，S7，S8，S9，S12為另一大類，與聚類分析結(jié)果相似。見表2。

圖4 12批比那甫西顆粒PCA分析結(jié)果 Fig.4 PCA analysis result of 12 batches of binafuxi granules

表2 主成分分析結(jié)果 Tab.2 Principal component analysis results

2.5含量測(cè)定[2-16]

2.5.1色譜條件 色譜柱Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表3中規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長272 nm(沒食子酸)、344 nm(秦皮乙素)、250 nm(甘草酸銨)；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

表3 流動(dòng)相梯度洗脫程序 Tab.3 Mobile phase gradient elution procedure

2.5.2系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別吸取“2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品、供試品溶液和陰性樣品溶液，依“2.5.1”項(xiàng)測(cè)定，供試品中3個(gè)成分的主峰與相鄰峰均能達(dá)到基線分離，分離度>1.5；供試品溶液色譜圖中，在與3個(gè)成分對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性無干擾。見圖5。

1.混合對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.不含山堇菜陰性對(duì)照溶液；D.不含玫瑰花陰性對(duì)照溶液；E.不含甘草浸膏陰性對(duì)照溶液；1.沒食子酸；2.秦皮乙素；3.甘草酸銨。圖5 5種溶液的HPLC色譜圖 A.mixed reference；B.sample；C.negative sample without viola tianshanica maxim；D.negative sample without rose；E.negative sample without licorice extract；1.gallic acid；2.aesculetin；3.ammonium glycyrrhizinate.Fig.5 HPLC chromatograms of five solution

2.5.3提取方法及提取時(shí)間考察 本實(shí)驗(yàn)對(duì)供試品的提取方法及提取時(shí)間進(jìn)行了篩選，結(jié)果加熱回流提取45 min時(shí)，3個(gè)指標(biāo)的提取效率最高，故選擇加熱回流提取45 min為供試品提取方法，見表4。

表4 提取方法及時(shí)間的考察結(jié)果 Tab.4 Investigation results of extraction method and time

2.5.4提取溶劑的考察 本實(shí)驗(yàn)對(duì)供試品的提取溶劑進(jìn)行了篩選，結(jié)果提取溶劑為50%甲醇時(shí)，3個(gè)指標(biāo)的提取效率相對(duì)較高，故選擇50%甲醇溶液為供試品提取溶液，結(jié)果見表5。

表5 提取溶劑的考察結(jié)果 Tab.5 Investigation results of extraction solvent

2.5.5線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.1.1”項(xiàng)混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.1，0.25，0.5，1.0，2.0，2.5 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，依“2.5.1”項(xiàng)測(cè)定。以對(duì)照品的進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。沒食子酸、秦皮乙素及甘草酸銨3個(gè)成分的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表6。

表6 3個(gè)成分線性方程 Tab.6 Linear equations of three components

2.5.6耐用性考察 本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同廠家色譜柱(Agilent、Thermo、Cosmosil)、不同柱溫(25，30，35 ℃)，不同流速(0.8，1.0，1.2 mL·min-1)進(jìn)行了考察，結(jié)果不同變動(dòng)因素對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響較小，均滿足系統(tǒng)適用性要求，見表7。

表7 3種成分耐用性考察結(jié)果 Tab.7 Durability test results of three components

2.5.7精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，依“2.5.1”項(xiàng)測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果1～3的峰面積RSD分別為0.59%，0.10%，0.89%，表明實(shí)驗(yàn)所用儀器精密度良好。

2.5.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批次供試品溶液(批號(hào)：Y180921)，10 ℃下分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)，依 “2.5.1”項(xiàng)測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果1～3的峰面積RSD分別為0.42%，0.43%，1.55%，表明供試品溶液在10 ℃放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.9重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次供試品(批號(hào)：Y180921)，按“2.1.2”項(xiàng)方法處理6份，依“2.5.1”項(xiàng)測(cè)定，計(jì)算1～3的含量。結(jié)果1～3含量的RSD分別為1.01%，0.73%，0.39%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.10日間精密度實(shí)驗(yàn) 取同一批次供試品(批號(hào)：Y180921)，不同人員在不同日期，按“2.1.2”項(xiàng)處理，按“2.5.1”項(xiàng)測(cè)定，計(jì)算1～3的含量。結(jié)果1～3含量的RSD分別為1.45%、1.56%、0.86%。表明該方法日間精密度良好。

2.5.11加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的樣品(批號(hào)：Y180921)約0.5 g，共6份，分別加入一定質(zhì)量濃度的沒食子酸、秦皮乙素、甘草酸銨對(duì)照品溶液適量，按“2.1.2”項(xiàng)方法處理，依“2.5.1”項(xiàng)測(cè)定，計(jì)算1～3的平均回收率，分別為102.18%，99.22%，102.04%，RSD分別為0.64%，1.12%，0.80%。

2.612批樣品含量測(cè)定 取12批比那甫西顆粒適量，按“2.1.2”項(xiàng)方法處理，依“2.5.1”項(xiàng)測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表8。

表8 樣品含量測(cè)定結(jié)果 Tab.8 Content determination results of samples mg·g-1

3 討論

3.1色譜條件優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)對(duì)3個(gè)成分的對(duì)照品溶液和供試品溶液在波長200～400 nm內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果波長為272 nm處供試品色譜峰數(shù)最多、基線分離最好，故選擇272 nm為指紋圖譜研究檢測(cè)波長；沒食子酸最大吸收波長272 nm，秦皮乙素最大吸收波長344 nm，甘草酸銨最大吸收波長250 nm，因此含量測(cè)定方法的檢測(cè)波長確定為250，272，344 nm。參考《中華人民共和國藥典》中秦皮乙素、沒食子酸及甘草酸銨的含量測(cè)定方法，考慮操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、節(jié)約、環(huán)保等因素，故選擇3個(gè)指標(biāo)同時(shí)測(cè)定。采用甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)秦皮乙素和沒食子酸的峰較寬，乙腈為流動(dòng)相時(shí)3個(gè)指標(biāo)的色譜峰均對(duì)稱性好、峰形優(yōu)，故采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相。

3.2指紋圖譜分析 本實(shí)驗(yàn)建立了比那甫西顆粒的指紋圖譜，確定21個(gè)共有峰，鑒定了5個(gè)成分。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，不同批次的樣品相似度均>0.9，相似性較好，差異較小，表明該制劑具有良好的穩(wěn)定性。

3.3聚類分析與主成分分析 通過對(duì)12批制劑進(jìn)行聚類分析和主成分分析，發(fā)現(xiàn)不同年份生產(chǎn)的制劑各為一類，并篩選出3個(gè)主成分，提示在藥物生產(chǎn)過程中需要重點(diǎn)關(guān)注該3種成分的變化。

3.4指標(biāo)成分的選擇 處方中天山堇菜和玫瑰花為君藥，而這兩種藥材現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均無含量測(cè)定項(xiàng)，且相關(guān)文獻(xiàn)較少。筆者通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比對(duì)及實(shí)驗(yàn)積累經(jīng)驗(yàn)確定了該制劑的含量測(cè)定指標(biāo)為秦皮乙素、沒食子酸，控制制劑中天山堇菜和玫瑰花的質(zhì)量；甘草浸膏占處方比例較大，因此選擇甘草酸銨為含量測(cè)定指標(biāo)，控制制劑中甘草浸膏的質(zhì)量。

3.5樣品測(cè)定分析 比那甫西顆粒12批含量測(cè)定結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)，秦皮乙素含量存在較大差別。筆者進(jìn)一步測(cè)定了制劑中所用的天山堇菜藥材，發(fā)現(xiàn)藥材中秦皮乙素的含量差異較大，造成了制劑含量的差異性，可能與采摘時(shí)間、地點(diǎn)、自然環(huán)境、存儲(chǔ)等條件有關(guān)。因此，在生產(chǎn)制劑中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注該藥材的質(zhì)量，保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性。

本研究建立的比那甫西顆粒HPLC特征指紋圖譜分析方法能夠全面系統(tǒng)地反映比那甫西顆粒的質(zhì)量，并建立了同時(shí)測(cè)定沒食子酸、秦皮乙素和甘草酸的方法，有效評(píng)價(jià)出不同批次的制劑質(zhì)量及需要關(guān)注的質(zhì)量標(biāo)志成分，提升了該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為比那甫西顆粒生產(chǎn)過程的監(jiān)控提供了理論依據(jù)，并為臨床安全有效的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。