逯 琴， 張文敏， 趙 敏

腦卒中是一種嚴(yán)重的心腦血管疾病，主要包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中主要表現(xiàn)為腦血管破裂或阻塞導(dǎo)致血流量減少，引起神經(jīng)功能受損，最終導(dǎo)致腦部病變，發(fā)病率、致死致殘率均極高[1,2]。缺血性腦卒中的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，多種因素導(dǎo)致神經(jīng)元損傷與凋亡，如代謝異常、氧化應(yīng)激及鈣離子超載等[3]，目前臨床上對(duì)于腦卒中仍缺少有效的治療藥物。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種單鏈環(huán)狀、共價(jià)閉合的非編碼RNA，可通過(guò)調(diào)控多種信號(hào)通路參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[4～6]。環(huán)狀RNA含HECT結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶1(circRNA HECT domain E3 ubiquitin ligase 1,Circ_HECTD1)在缺血腦組織中表達(dá)升高，抑制Circ_HECTD1表達(dá)能夠顯著改善腦梗死，減輕神經(jīng)元損傷[7]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-135a-5p在氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中表達(dá)減少，過(guò)表達(dá)miR-135a-5p能夠顯著改善OGD/R誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡[8]。腫瘤蛋白53誘導(dǎo)型核蛋白1(tumor protein 53-induced nuclear protein 1,TP53INP1)是一種促凋亡蛋白，參與多種腫瘤引起的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，可誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，引起細(xì)胞凋亡[9,10]。生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)可知TP53INP1是miR-135a-5p的靶基因。本研究通過(guò)進(jìn)行體外OGD/R誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷，觀察Circ_HECTD1對(duì)HT22細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及對(duì)miR-135a-5p/TP53INP1軸的調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 HT22小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞由中科院細(xì)胞生物研究所提供。胎牛血清(FBS,10099-141)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(BT11668-019)均購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；青鏈霉素(R3470)購(gòu)自北京康納瑞生物公司；si-Circ_HECTD1、miR-135a-5p模擬物(miR-135a-5p)、anti-miR-135a-5p及其陰性轉(zhuǎn)染物(si-NC、miR-NC、anti-miR-NC)、Circ_HECTD1野生型質(zhì)粒(Circ_HECTD1-WT)與突變型質(zhì)粒(Circ_HECTD1-MUT)、TP53INP1野生型質(zhì)粒(TP53INP1-WT)與突變型質(zhì)粒(TP53INP1-MUT)均購(gòu)自北京六合華大基因公司；TRIzol試劑盒(SH-2366)購(gòu)自北京凱詩(shī)源生物公司；熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(BK2100)購(gòu)自百奧邁科生物公司；MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(M1020)購(gòu)自北京索萊寶生物公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(K201-100)購(gòu)自北京博邁斯科技公司；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)試劑盒(AAT-12518)購(gòu)自美國(guó)AAT Bioquest公司；Bax抗體(ab182733)、Bcl-2抗體(ab196495)、TP53INP1抗體(ab202026)、羊抗兔二抗(ab6721)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 主要儀器 JD-CW16實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自山東競(jìng)道光電科技有限公司；EXFLOW系列流式細(xì)胞儀購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)公司；LONZA ELx808酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)LONZA公司；Azure Biosystems C150凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Azure公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組轉(zhuǎn)染 常規(guī)培養(yǎng)復(fù)蘇HT22細(xì)胞，并培養(yǎng)于含10% FBS，1%青鏈霉素雙抗的正常DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞融合≥80%后采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒將si-NC、si-Circ_HECTD1、miR-NC、miR-135a-5p、si-Circ_HECTD1+anti-miR-NC、si-Circ_HECTD1+anti-miR-135a-5p分別轉(zhuǎn)染至HT22細(xì)胞中，依次作為si-NC組、si-Circ_HECTD1組、miR-NC組、miR-135a-5p組、si-Circ_HECTD1+anti-miR-NC組、si-Circ_HECTD1+anti-miR-135a-5p組，另將未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為Con組、OGD/R組。

1.4 模型建立 除Con組外，其它7組建立OGD/R模型：棄去原來(lái)的培養(yǎng)液，PBS沖洗細(xì)胞，加入不含F(xiàn)BS的無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，置于常規(guī)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，轉(zhuǎn)移至含有94%N2、5%CO2、1%O2的缺氧培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，然后更換正常DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至常規(guī)恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.5 qRT-PCR法檢測(cè)Circ_HECTD1、miR-135a-5p、TP53INP1 mRNA表達(dá) 收集各組HT22細(xì)胞，采用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Circ_HECTD1、miR-135a-5p、TP53INP1 mRNA表達(dá)，以GAPDH和U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR所需引物：Circ_HECTD1上游引物5’-CACGTGTTATCAGGGGCCTT-3’，下游引物5’-CGCCACCCTTGCTTTTCATC-3’；miR-135a-5p上游引物5’-ACAGCCTCCATGGGAATGGAAGCAGGTTGA-3’，下游引物5’-TGGAGTGTGGCGTTCG-3’；TP53INP1上游引物5’-TGGCACTTATTTCCGCCTGTA-3’，下游引物5’-CGTGGCTGGAAGAAGTAGTGA-3’；U6上游引物5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下游引物5’-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；GAPDH上游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 收集各組HT22細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個(gè)/ml，接種至96孔板，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，待細(xì)胞鋪滿孔底，每孔加入5 mg/ml MTT溶液10 μl，37 ℃培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μl，搖床上震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，使用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(OD值)，計(jì)算各組細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/Con組OD值×100%。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組HT22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml。取500 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl Annexin V-FITC溶液和5 μl PI溶液，孵育10 min，混勻后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-135a-5p與Circ_HECTD1、TP53INP1的靶向關(guān)系 根據(jù)miR-135a-5p與Circ_HECTD1、TP53INP1序列間的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建Circ_HECTD1、TP53INP1野生型和突變型質(zhì)粒載體(Circ_HECTD1-WT與Circ_HECTD1-MUT、TP53INP1-WT與TP53INP1-MUT)，并將其分別與miR-NC和miR-135a-5p共轉(zhuǎn)染至HT22細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性，以螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值作為相對(duì)熒光素酶活性。

1.9 Western blot法檢測(cè)Bax、Bcl-2、TP53INP1蛋白表達(dá) 收集各組HT22細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h，加入Bax、Bcl-2、TP53INP1一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，再加入HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育2 h，ECL顯色后使用凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像并分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 Circ_HECTD1、miR-135a-5p、TP53INP1在OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷中的表達(dá) 與Con組比較，OGD/R組Circ_HECTD1與TP53INP1 mRNA表達(dá)均上調(diào)，miR-135a-5p表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。結(jié)果(見(jiàn)表1)。

表1 各組HT22細(xì)胞中Circ_HECTD1、miR-135a-5p、TP53INP1 mRNA表達(dá)比較

2.2 沉默Circ_HECTD1表達(dá)對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷及miR-135a-5p、TP53INP1表達(dá)的影響 與Con組比較，OGD/R組HT22細(xì)胞存活率和Bcl-2蛋白表達(dá)降低，凋亡率和Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與OGD/R組、si-NC組比較，si-Circ_HECTD1組Circ_HECTD1、TP53INP1 mRNA和蛋白表達(dá)降低，miR-135a-5p表達(dá)升高，存活率和Bcl-2蛋白表達(dá)升高，凋亡率和Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)果(見(jiàn)圖1、圖2和表2、表3)。

表2 各組HT22細(xì)胞Circ_HECTD1、miR-135a-5p、TP53INP1 mRNA表達(dá)存活率、凋亡率比較

表3 各組HT22細(xì)胞中TP53INP1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

圖1 各組HT22細(xì)胞凋亡流式圖

A：Con組；B：OGD/R組；C：si-NC組；D：si-Circ_HECTD1組圖2 各組HT22細(xì)胞中TP53INP1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

2.3 Circ_HECTD1與miR-135a-5p、miR-135a-5p與TP53INP1的靶向關(guān)系 生物信息學(xué)網(wǎng)站(https://starbase.sysu.edu.cn/index.php)預(yù)測(cè)可知，Circ_HECTD1與miR-135a-5p、miR-135a-5p與TP53INP1序列間均具有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)圖3)。與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-135a-5p的HT22細(xì)胞中Circ_HECTD1-WT以及TP53INP1-WT的相對(duì)熒光素酶活性降低(P<0.05)；但對(duì)Circ_HECTD1-MUT和TP53INP1-MUT的相對(duì)熒光素酶活性無(wú)顯著影響(P>0.05)。結(jié)果(見(jiàn)表4)。

表4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

圖3 Circ_HECTD1與miR-135a-5p、miR-135a-5p與TP53INP1結(jié)合位點(diǎn)

2.4 過(guò)表達(dá)miR-135a-5p對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷及TP53INP1表達(dá)的影響 與Con組比較，OGD/R組TP53INP1 mRNA和蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)；與OGD/R組、miR-NC組比較，miR-135a-5p組miR-135a-5p表達(dá)升高，TP53INP1 mRNA和蛋白表達(dá)均降低，細(xì)胞存活率和Bcl-2蛋白表達(dá)升高，凋亡率和Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)果(見(jiàn)圖4、圖5和表5、表6)。

表5 各組HT22細(xì)胞miR-135a-5p、TP53INP1 mRNA表達(dá)、存活率與凋亡率比較

表6 各組HT22細(xì)胞中TP53INP1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

圖4 各組HT22細(xì)胞凋亡流式圖

A：Con組；B：OGD/R組；C：miR-NC組；D：miR-135a-5p組圖5 各組HT22細(xì)胞中TP53INP1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

2.5 抑制miR-135a-5p逆轉(zhuǎn)沉默Circ_HECTD1表達(dá)對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷的影響 與si-Circ_HECTD1+anti-miR-NC組比較，si-Circ_HECTD1+anti-miR-135a-5p組miR-135a-5p表達(dá)降低，TP53INP1 mRNA和蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞存活率和Bcl-2蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。結(jié)果(見(jiàn)圖6、圖7和表7、表8)。

表7 各組HT22細(xì)胞miR-135a-5p、TP53INP1 mRNA表達(dá)、存活率與凋亡率比較

表8 各組HT22細(xì)胞TP53INP1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

si-Circ_HECTD1+anti-miR-NC組；si-Circ_HECTD1+anti-miR-135a-5p組圖6 各組HT22細(xì)胞凋亡流式圖

A：si-Circ_HECTD1+anti-miR-NC組；B：si-Circ_HECTD1+anti-miR-135a-5p組圖7 各組HT22細(xì)胞TP53INP1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

3 討 論

近年來(lái)腦卒中的發(fā)病率與死亡率逐年升高，目前臨床上對(duì)于腦卒中的治療藥物主要是神經(jīng)保護(hù)類(lèi)藥物，其靶點(diǎn)單一，易出現(xiàn)耐藥性，尋找新的治療靶點(diǎn)是腦血管疾病的研究重點(diǎn)[11,12]。細(xì)胞凋亡是缺血性腦卒中神經(jīng)元損傷的主要形式，缺血后腦組織中大量氧自由基的產(chǎn)生導(dǎo)致促炎因子釋放，最終引起細(xì)胞損壞和凋亡[13,14]。海馬區(qū)是腦缺血后最易受損的區(qū)域[15]，本實(shí)驗(yàn)采用小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞建立OGD/R誘導(dǎo)細(xì)胞損傷體外模型，結(jié)果顯示，OGD/R誘導(dǎo)后HT22細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高，Bax表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低，提示海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞受損，細(xì)胞發(fā)生凋亡，與袁美玲等[16]研究結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn)[17]，沉默Circ_HECTD1表達(dá)可有效降低癲癇模型小鼠海馬神經(jīng)元凋亡，減輕炎癥反應(yīng)。另有研究證實(shí)[18]，Circ_HECTD1敲除后，通過(guò)調(diào)節(jié)miR-27a-3p/FSTL1軸，減輕OGD/R誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷，為腦梗死的治療提供新的靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)沉默Circ_HECTD1可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡減輕HT22細(xì)胞損傷，與Zhang等[18]研究結(jié)果一致，但具體作用機(jī)制尚不完全清晰。

miR-135a-5p已被證實(shí)在腦缺氧/復(fù)氧損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，M2小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的miR-135a-5p表達(dá)上調(diào)，抑制神經(jīng)元自噬，減輕缺血性腦損傷[20]。TP53INP1影響OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞活力，促進(jìn)神經(jīng)元中炎癥與氧化應(yīng)激的發(fā)生，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21,22]。本研究結(jié)果顯示，HT22細(xì)胞中TP53INP1上調(diào)，miR-135a-5p下調(diào)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)TP53INP1是miR-135a-5p的靶基因；且過(guò)表達(dá)miR-135a-5p可通過(guò)下調(diào)TP53INP1表達(dá)減輕HT22細(xì)胞損傷。另外，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)，miR-135a-5p是Circ_HECTD1的靶基因；且沉默Circ_HECTD1可顯著上調(diào)miR-135a-5p表達(dá)，下調(diào)TP53INP1表達(dá)，而抑制miR-135a-5p表達(dá)能夠顯著逆轉(zhuǎn)沉默Circ_HECTD1對(duì)HT22細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。以上研究結(jié)果提示Circ_HECTD1可通過(guò)調(diào)控miR-135a-5p/TP53INP1信號(hào)軸發(fā)揮對(duì)海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，沉默Circ_HECTD1表達(dá)能夠有效減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，保護(hù)OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷，且其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)miR-135a-5p/TP53INP1信號(hào)軸有關(guān)。但目前缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，Circ_HECTD1在缺血性腦卒中的研究尚少，其具體影響機(jī)制還需進(jìn)一步深入探索。