高英姿

（武漢市新洲區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，湖北 武漢 431400）

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病。結(jié)核病可累及患者全身的多個(gè)器官，其中累及肺部（肺結(jié)核）最為常見(jiàn)。結(jié)核病在臨床上多表現(xiàn)為慢性病程，少數(shù)患者可能存在急性起病的情況[1-2]。結(jié)核病的治療時(shí)間較長(zhǎng)，抗結(jié)核藥物的副作用較大，易導(dǎo)致患者機(jī)體的免疫力下降，出現(xiàn)一些并發(fā)癥[3]。當(dāng)前由于抗生素、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑的廣泛使用，導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌的耐藥性不斷增強(qiáng)。如何有效檢測(cè)并控制結(jié)核病已成為現(xiàn)階段臨床上討論的熱點(diǎn)問(wèn)題[4-5]。菌陰肺結(jié)核是指至少經(jīng)3 次痰涂片檢查及1次痰培養(yǎng)檢查結(jié)果呈陰性的一類(lèi)肺結(jié)核[6-7]。作為菌陰肺結(jié)核臨床診斷的重要措施之一，支氣管鏡檢查不僅能直觀地觀察患者病灶的情況，還可取其支氣管沖洗液進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)室檢查，為本病的診斷及治療提供重要的參考依據(jù)[8]。本文主要是探討不同支氣管沖洗液結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)法在菌陰肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019 年12 月至2020 年12 月我院收治的60 例疑似患有菌陰肺結(jié)核的患者作為研究對(duì)象。其納入標(biāo)準(zhǔn)是：疑似患有菌陰肺結(jié)核，存在低熱、盜汗、納差、咳嗽、咳痰、胸痛、胸悶等癥狀，但無(wú)消瘦、咯血、乏力癥狀；臨床資料齊全；知曉本研究?jī)?nèi)容，并簽署了知情同意書(shū)。其排除標(biāo)準(zhǔn)是：患有活動(dòng)性肺結(jié)核；合并有惡性腫瘤或其他嚴(yán)重的器質(zhì)性疾??；存在心、肝、腎、腦等器官功能障礙；存在意識(shí)障礙或精神障礙，無(wú)法與醫(yī)護(hù)人員正常交流；中途退出本研究或存在其他可能對(duì)本研究結(jié)果造成影響的因素。在這些患者中，有男性患者33 例，女性患者27 例；其年齡為18 ～31 歲，平均年齡為（25.12±1.22）歲；其臨床癥狀持續(xù)的時(shí)間為1 ～27 個(gè)月，平均時(shí)間為（17.14±1.22）個(gè)月。

1.2 方法

1.2.1 支氣管鏡檢查 對(duì)60 例患者進(jìn)行支氣管鏡檢查的方法是：對(duì)其進(jìn)行局部麻醉，從鼻腔置入支氣管鏡。在支氣管鏡下對(duì)患者的肺部、支氣管黏膜等進(jìn)行觀察，了解有無(wú)異常。經(jīng)支氣管鏡的活檢孔用5 ～10mL 的生理鹽水沖洗肺臟和支氣管，隨后利用吸引器將沖洗液吸出并置入標(biāo)本瓶中。

1.2.2 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng) 對(duì)60 例患者均進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，采用全自動(dòng)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢測(cè)儀實(shí)施標(biāo)本培養(yǎng)及病原菌分離等操作。取患者的支氣管沖洗液標(biāo)本，在血平板與麥康凱平板上接種標(biāo)本，置于25℃的恒溫箱中培養(yǎng)18 ～24 h，觀察標(biāo)本中菌落生長(zhǎng)的情況，之后開(kāi)展革蘭染色、菌種分離與鑒定等操作。

1.2.3 涂片法采用涂片法 對(duì)患者的支氣管沖洗液進(jìn)行檢測(cè)的方法是：取支氣管沖洗液標(biāo)本，將其均勻涂抹于載玻片上，之后采用萋- 尼氏染色抗酸染色法進(jìn)行抗酸桿菌檢測(cè)。當(dāng)持續(xù)觀察300 個(gè)視野發(fā)現(xiàn)3 條或3 條以上的抗酸桿菌時(shí)，可判斷檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，反之則表示檢測(cè)結(jié)果呈陰性。

1.2.4 噬菌體生物擴(kuò)增法 采用噬菌體生物擴(kuò)增法對(duì)患者的支氣管沖洗液進(jìn)行檢測(cè)的方法是：用結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)操作。陽(yáng)性結(jié)果判讀：1）噬菌體斑融合，并表現(xiàn)為透明狀；2）噬菌斑數(shù)量＞20 個(gè)。上述條件符合其中任意1 條，即可判斷檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。1.2.5 熒光定量PCR 法 采用熒光定量PCR 法對(duì)患者的支氣管沖洗液進(jìn)行檢測(cè)的方法是：取支氣管沖洗液標(biāo)本，對(duì)其進(jìn)行離心處理，取上清液。將上清液反復(fù)沉淀后與無(wú)菌生理鹽水混合，置于PCR 反應(yīng)管中實(shí)施定量PCR 擴(kuò)增處理，最后利用KAPA 定量熒光PCR 法對(duì)結(jié)核分枝桿菌基因的數(shù)量進(jìn)行測(cè)定。陽(yáng)性結(jié)果判讀：若結(jié)核分枝桿菌基因數(shù)量超過(guò)1×103拷貝/mL，則可判斷檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察對(duì)60 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的結(jié)果。觀察用涂片法、噬菌體生物擴(kuò)增法和熒光定量PCR法對(duì)60 例患者的支氣管沖洗液進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果。比較用涂片法、噬菌體生物擴(kuò)增法和熒光定量PCR 法診斷菌陰肺結(jié)核的效能。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 20.0 軟件處理本研究中的數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用% 表示，用χ2 檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)60 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的結(jié)果

對(duì)本研究中60 例患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的結(jié)果顯示，其中有24 例患者的培養(yǎng)結(jié)果呈陽(yáng)性（表示其患有菌陰肺結(jié)核），其余36 例患者的培養(yǎng)結(jié)果均呈陰性（表示其患有其他疾?。?。

2.2 用涂片法、噬菌體生物擴(kuò)增法和熒光定量PCR法對(duì)60 例患者的支氣管沖洗液進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果

采用涂片法對(duì)60 例患者的支氣管沖洗液進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示，其中有23 例患者的檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性（表示其患有菌陰肺結(jié)核），其余37 例患者的檢測(cè)結(jié)果均呈陰性（表示其患有其他疾?。?。采用噬菌體生物擴(kuò)增法對(duì)60 例患者的支氣管沖洗液進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示，其中有24 例患者的檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性（表示其患有菌陰肺結(jié)核），其余36 例患者的檢測(cè)結(jié)果呈陰性（表示其患有其他疾?。２捎脽晒舛縋CR 法對(duì)60 例患者的支氣管沖洗液進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示，其中有27 例患者的檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性（表示其患有菌陰肺結(jié)核），其余33 例患者的檢測(cè)結(jié)果呈陰性（表示其患有其他疾?。?。詳見(jiàn)表1。

表2 用涂片法、噬菌體生物擴(kuò)增法和熒光定量PCR 法對(duì)60例患者的支氣管沖洗液進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果（例）

2.3 用涂片法、噬菌體生物擴(kuò)增法和熒光定量PCR 法診斷菌陰肺結(jié)核的效能

用涂片法診斷60 例患者菌陰肺結(jié)核的敏感度為91.67%（22/24）、特異度為97.22%（35/36）、準(zhǔn)確率為95.00%（57/60）。用噬菌體生物擴(kuò)增法診斷60例患者菌陰肺結(jié)核的敏感度為87.50%（21/24）、特異度為91.67%（33/36）、準(zhǔn)確率為90.00%（54/60）。用熒光定量PCR 法診斷60 例患者菌陰肺結(jié)核的敏感度為58.33%（14/24）、特異度為63.89%（23/36）、準(zhǔn)確率為61.67%（37/60）。用涂片法、噬菌體生物擴(kuò)增法診斷60 例患者菌陰肺結(jié)核的敏感度、特異度、準(zhǔn)確率與結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法的一致性較好，效果較佳，顯著優(yōu)于熒光定量PCR 法。

3 討論

肺結(jié)核是一種危害較大的慢性傳染病[9-10]。此病的傳播特點(diǎn)是：1）傳染性強(qiáng)。作為一種傳染性強(qiáng)的疾病，肺結(jié)核的傳播途徑主要是飛沫傳染[11]。肺結(jié)核患者在打噴嚏、咳嗽或說(shuō)話時(shí)，都有可能將帶有結(jié)核分枝桿菌的飛沫傳播到空氣中，健康人在呼吸到被污染的空氣之后，就可能發(fā)生結(jié)核分枝桿菌感染。2）傳播速度快。結(jié)核分枝桿菌在傳播的過(guò)程中，若傳播途徑合適，且患者存在易感體質(zhì)，結(jié)核分枝桿菌就會(huì)在短時(shí)間內(nèi)侵入易感人群（如體質(zhì)較差的嬰幼兒、老年人及營(yíng)養(yǎng)不良者）的體內(nèi)，其傳播速度較快[12]。3）傳播的范圍廣。肺結(jié)核患者的病情在確診之前，會(huì)有一段時(shí)間的潛伏期。由于本病的傳染性較強(qiáng)，且結(jié)核分枝桿菌在進(jìn)入外界環(huán)境中也可以長(zhǎng)時(shí)間存活，因此不需要被感染者與感染者有直接身體接觸便可能發(fā)生感染[13]。在肺結(jié)核診治的過(guò)程中，早期明確診斷此病對(duì)治療方案的選擇及提高患者的療效具有重要的意義[14]。菌陰肺結(jié)核患者在患病的早期缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，且對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查的結(jié)果可能呈陰性，因此其病情在持續(xù)進(jìn)展后可能會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥狀。因此，臨床上對(duì)菌陰肺結(jié)核進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷和及時(shí)的治療至關(guān)重要。對(duì)菌陰肺結(jié)核患者進(jìn)行支氣管鏡檢查可直觀地觀察其病灶的情況，還可利用生理鹽水沖洗其支氣管和肺部，采集沖洗液開(kāi)展細(xì)胞學(xué)檢查，進(jìn)而有助于診斷其病情。目前臨床上對(duì)菌陰肺結(jié)核患者的支氣管沖洗液進(jìn)行檢測(cè)的方法較多，包括涂片法、噬菌體生物擴(kuò)增法和熒光定量PCR 法等。涂片法屬于細(xì)菌學(xué)檢查中最基礎(chǔ)的一種方法，即利用石碳酸復(fù)紅進(jìn)行初染，隨后用鹽酸、酒精處理，用堿性美藍(lán)進(jìn)行復(fù)染，此時(shí)標(biāo)本中若含有結(jié)核分枝桿菌，則會(huì)表現(xiàn)為紅色。在結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁中，肽聚糖外周存在大量的脂肪，著色較為困難，且用酸性脫色劑脫色也較為困難，因此通過(guò)染色能有效判斷標(biāo)本中是否存在結(jié)核分枝桿菌。熒光定量PCE 法即利用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針或熒光染料，對(duì)結(jié)核分枝桿菌中的某一特定核酸序列DNA 拷貝數(shù)量實(shí)施迅速擴(kuò)增，隨后臨床醫(yī)師利用DNA 探針、PCR 雜交技術(shù)對(duì)熒光的變化進(jìn)行觀察，并記錄NDA 模板定量，從而實(shí)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)的一種方法。但該檢測(cè)方法對(duì)檢驗(yàn)人員的技術(shù)水平、專(zhuān)業(yè)知識(shí)及經(jīng)驗(yàn)的要求較高，同時(shí)需要有專(zhuān)業(yè)的檢測(cè)設(shè)備，故不利于在基層醫(yī)院推廣。噬菌體生物擴(kuò)增法是一種檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌是否存活或耐藥的方法。其檢測(cè)原理是，利用恥垢分枝桿菌作為輔助細(xì)菌，在結(jié)核分枝桿菌內(nèi)增殖的子代噬菌體釋放出來(lái)后感染、裂解恥垢分枝桿菌，根據(jù)24h 內(nèi)是否形成清晰的噬菌斑來(lái)判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌活菌，以及結(jié)核分枝桿菌是否耐藥。該檢測(cè)方法對(duì)檢驗(yàn)人員技術(shù)水平和檢測(cè)設(shè)備的要求均較低，且在24h 左右便可得出檢測(cè)結(jié)果，具有較好臨床應(yīng)用前景。在采用噬菌體生物擴(kuò)增法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌時(shí)，若檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)誤差，可能與標(biāo)本采集不當(dāng)、患者感染的時(shí)間短、活性菌數(shù)量較少及噬菌體的濃度等存在一定的關(guān)系。

本研究的結(jié)果證實(shí)，采用涂片法、噬菌體生物擴(kuò)增法對(duì)菌陰肺結(jié)核患者的支氣管沖洗液進(jìn)行檢測(cè)的效果較佳，臨床診斷價(jià)值較高，而用熒光定量PCR 法對(duì)此病患者的支氣管沖洗液進(jìn)行檢測(cè)則存在一定的誤差性。本研究也存在一定的不同之處，例如部分患者的遵醫(yī)囑性較差，影響其檢測(cè)結(jié)果；樣本量小，研究時(shí)間較短等。因此，在后期的研究中應(yīng)加強(qiáng)與患者進(jìn)行溝通，使其能夠積極地配合研究與治療，并延長(zhǎng)研究時(shí)間，加大樣本量，為菌陰肺結(jié)核的臨床診治提供更科學(xué)的數(shù)據(jù)。